[发明专利]一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物

说明书

本发明提供了一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物，该含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物的分子结构式为^m7UNGpppA_2’OmepG，本发明提供的含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物具有更高的mRNA体外转录效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻译效率。

技术领域

本发明涉及化学及生物工程技术领域，具体涉及一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物。

背景技术

在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”，所述帽包含有在两个核苷部分之间的5'-5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基，mRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中，体外转录合成mRNA使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。mRNA的体外转录产率以及5’位加帽类似物是mRNA制备过程的关键工艺。目前应用于mRNA化学法加帽的体系，无法获得较高的效率。

专利CN201680067458.6报道了用于合成5’-加帽RNA的组合物和方法。其中起始加帽寡核苷酸引物具有通式形式m⁷Gppp[N_2，Ome]_n[N]_m，其中m⁷G为N₇-甲基化的鸟苷或任何鸟苷类似物，N为任何天然的、修饰的或非天然的核苷，“n”可以是从0至4的任何整数且“m”可以是从1至9的整数。Cleancap属于Cap1，与ARCA使用二聚体(m⁷GpppG)启动T7转录不同，CleanCap使用三聚体(m⁷GpppAmG)启动T7转录。该方法的产量比较高，每毫升转录反应体系制备4mg加帽的RNA，加帽效率可达90％，其转录产物的免疫原性低于ARCA。

专利US10968248B2公开了TrinucleotidemRNAcapanalogs，涉及三核苷酸帽类似物，用于改善体外mRNA合成和m⁷G(5’)p₃-RNA转录。该结构中在帽子结构中的第三个核苷酸采用开环的UNA替代，由于是转录的起始核苷酸，不利于T7RNA聚合酶的识别，降低了加帽效率，也降低了体外转录的效率。

因此，本领域迫切需要开发一类新的加帽类似物组合，从而使体外转录合成的mRNA能够获得更高的体外转录产量、更高的加帽效率、更低的免疫原性。

发明内容

为了解决现有技术中体外转录产量以及加帽效率不足等问题。本申请提供了一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物，该含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物结构中含有UNA结构替换原有的五元糖环结构，替换后由于UNA无法作为转录的起始位点，具有很好的mRNA体外转录时抗反转录效果，最终使mRNA获得更高的加帽效率；UNA的开环结构，帮助mRNA逃脱体内免疫系统识别，更好的降低免疫原性；同时，由于非天然核苷酸UNA的引入，使得mRNA不容易被核酶水解，增加了mRNA加帽后在体内的稳定性。

一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物，其包含以下结构：

其中，R₁和R₂独立的为H、OH、烷基、O-烷基、卤素；

X₁、X₂和X₃分别独立的为O、CH₂或NH；