[发明专利]一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法

说明书

本发明公开了一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法，水稻增强子，序列如SEQ ID NO.1。获取增强子，长度为461 bp；LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62 bp mini启动子序列；构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达；构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini启动子中间插入igENH1增强子序列；水稻原生质体的制备与转化；转化后通过分析增强子活性。所述水稻增强子具有较好的增强转录效果。

技术领域

本发明涉及增强子及鉴定方法，特别涉及水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术鉴定水稻增强子的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是目前用于基因组定向编辑的主要工具。该系统研究最深入且应用最广泛，主要成分有Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA、相应的目标DNA等。CRISPR/Cas9系统作用机制是crRNA和tracrRNA通过碱基配对形成发夹结构的sgRNA，在sgRNA引导下Cas9蛋白识别靶位点3’端PAM序列并与靶位点结合，利用Cas9内切核酸酶的活性切割靶位点，造成DNA双链断裂。在修复过程中断裂处DNA引入碱基缺失替换等，从而实现对基因组目标序列的定向编辑。

水稻基因组除了编码蛋白质的基因外，还存在大量非编码序列，其中包括顺式调控元件(启动子、增强子等)。顺式调控元件在调控基因表达方面发挥重要作用。本发明鉴定到一段增强子序列，应用mini启动子和增强子组合的调控模块，驱动CRISPR/Cas9表达，实现基因编辑的效果。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种水稻增强子。

本发明的另一目的是提供所述基于CRISPR/Cas9技术鉴定水稻增强子的方法。

技术方案：本发明提供一种水稻增强子，基因序列如SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

进一步地，所述水稻内含子来源于禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativaL.spp.Japonica var.Nipponbare)，具体用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到461bp的扩增产物。

进一步地，引物序列如下：

正向F：5’-GCAGAAATGCAAATTTCATA-3’；

反向R：5’-AATCTGTTCATATAAACTGG-3’。

水稻增强子的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)通过分析开放染色质数据，发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因间区存在开放染色质位点，经分析为增强子，命名为igENH1(intergenic enhancer 1)，长度为461bp。

(2)LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62bp mini启动子序列。

(3)构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达。

(4)构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini启动子中间插入igENH1增强子序列。

(5)水稻原生质体的制备与转化。

(6)转化后通过分析编辑位点是否发生突变评估增强子活性。

鉴定原理：