[发明专利]一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法有效
| 申请号： | 202210454378.3 | 申请日： | 2022-04-27 |
| 公开（公告）号： | CN114774420B | 公开（公告）日： | 2023-09-22 |
| 发明（设计）人： | 刘鹏;吴怡;庞天添;张韬 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/82 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 柏尚春 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 水稻 增强 基于 crispr cas9 技术 评估 活性 方法 | ||
1.一种水稻增强子，其特征在于：基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的水稻增强子，其特征在于：所述水稻增强子的制备方法为用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到461 bp的扩增产物即为水稻增强子。
3.根据权利要求2所述的水稻增强子，其特征在于：所述引物序列如下：
正向F: 5’-GCAGAAATGCAAATTTCATA-3’ ；
反向R: 5’-AATCTGTTCATATAAACTGG-3’ 。
4.一种基于CRISPR/Cas9技术评估权利要求1所述水稻增强子活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1) 通过分析开放染色质数据，发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因间区存在开放染色质位点，经分析为增强子，命名为igENH1 intergenic enhancer 1，长度为461bp，即为权利要求1所述的增强子；
(2) LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62 bp mini启动子序列；所述mini启动子序列如下：
TCTATAAATTCCTCCCCCCTTTTCCCCTCTCTATATAGGAGGCATCCAAGCCAAGAAGAGGG
(3) 构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达；
(4) 构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini 启动子中间插入igENH1增强子序列；
(5) 水稻原生质体的制备与转化；
(6) 转化后通过分析编辑位点是否发生突变评估增强子活性。
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