[发明专利]一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法

说明书

本发明公开了一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，（1）以野生型木霉菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获取hacI编码序列上游片段和hacI编码区部分片段，分别命名为UF和DF；（2）以质粒pUC19‑hph‑Ptef1为模板进行PCR扩增，获取包含潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉QM6a中tef1基因启动子序列的片段Ptef1，命名为hph‑Ptef1；（3）利用重叠PCR方法将上述3个片段按以下顺序连接，UF、hph‑Ptef1、DF获得超表达元件，命名为UF‑hph‑Ptef1‑DF；（4）将步骤（3）中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素B筛选、PCR验证和HPLC检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株OEhacI。本发明的方法构建的harzianic acid高产菌株，在发酵4天即可在常规培养基PDB中摇瓶产生大量harzianic acid，从而为规模化生产harzianic acid提供有效开发技术和相应工程生产菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法。

背景技术

Harzianic acid及其衍生物是一类具有多种功能活性的木霉菌次生代谢产物，不仅能够强烈抑制多种植物病原真菌如立枯丝核菌、核盘菌、尖孢镰刀菌等的生长，也能够促进番茄、大豆、油菜和草莓等多种农作物的生长，提高其产量并改善果实营养成分。此外，harzianic acid还具有络合重金属离子(镉、铅、镍、钴等)的能力，能够提高植物在重金属污染土壤中的耐受性。因此，harzianic acid 在农业生产实践中具有重要的应用价值。然而，木霉菌次生代谢产物生物合成基因簇多处于沉默或低表达状态，目前野生状态下未发现其高产菌株，这极大地限制了harzianic acid的规模化生产和进一步应用。

本发明通过基因克隆了具有激活harianic acid生物合成功能的转录因子编码基因(命名为hacI)，并利用其构建了在短时间液体发酵条件下(PDB、25℃、 170rpm、4天)能够大量合成harzianic acid的木霉菌株OEhacI，为高产harzianic acid工程菌株的构建提供了一种新的思路和方法。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法；本发明的第二个目的是提供前述构建方法构建得到的基因工程菌。本发明利用组成型启动子Ptef1，定点激活转录因子编码基因hacI的超表达，大幅提高harzianic acid生物合成基因簇整体转录水平，从而获得高产 harzianic acid的木霉工程菌株

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种harzianic acid高产木霉菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)以野生型木霉菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获取hacI编码序列上游片段和hacI编码区部分片段，分别命名为UF和DF；

(2)以质粒pUC19-hph-Ptef1为模板进行PCR扩增，获取包含潮霉素B磷酸转移酶元件hph和里氏木霉QM6a中tef1基因启动子序列的片段Ptef1，命名为 hph-Ptef1；

(3)利用重叠PCR方法将上述3个片段按以下顺序连接，UF、hph-Ptef1、DF,获得超表达元件，命名为UF-hph-Ptef1-DF；

(4)将步骤(3)中超表达元件转入木霉菌的原生质体中，经潮霉素B筛选、PCR 验证和HPLC检测后，获得高产harzianic acid的木霉菌株OEhacI。

进一步的，所述的出发菌株野生型木霉菌株为沈氏木霉(Trichoderma shenii)NJAU4742，于2020年07月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19936，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。