[发明专利]适于ONT测序平台的用于感样本中鼻病毒检测的靶向区段和引物组及其应用

说明书

本申请涉及生物信息学技术领域，具体基于生信引物设计提供了一种适于ONT测序平台的用于感样本中鼻病毒检测的靶向区段和引物组及其应用。本发明引物能快速、高效、高特异、高灵敏地从呼吸道感染体征和症状的患者中识别和鉴别鼻病毒不同类型。

技术领域

本发明属于生物信息学分析技术领域，具体涉及一种适于ONT测序平台的用于感样本中鼻病毒检测的靶向区段和引物组及其应用。

背景技术

人鼻病毒(HRVs)是世界范围内人类感染的最常见原因。它是小核糖核酸病毒科肠病毒属的成员，属于小型病毒(直径30纳米)，单链RNA基因组中包含7000到7500个核苷酸，被包裹在二十面体衣壳中。HRVs目前已在“在人体感染中发现HRV多达150至170种基因型(图1)，其中大约83种HRV-A型、32种HRV-B型和55种HRV-C型”。

鼻病毒是普通感冒的常见原因，但也经常出现在中耳炎、鼻窦炎、支气管炎、肺炎和哮喘恶化中，其中鼻病毒A型(HRV-A)和鼻病毒C型(HRV-C)通常与反复喘息的发生有关，并且HRV-A(54.7％)和HRV-C(39.9％)占HRV感染的大多数。

鼻病毒感染的鉴别诊断在流行病学上很重要。由于其巨大的遗传多样性(150个血清型)，每年RV感染的复发非常典型。鼻病毒的特异性识别已经对患者的支持性疗法产生了影响，当有特异性抗病毒药物可用时，这一点将变得更加重要。核酸扩增技术已经取代细胞培养物中病毒的分离，成为检测小核糖核酸病毒的首选方法，部分原因是这种技术具有突出的灵敏度、特异性和快速性。鼻病毒有保守的5’非编码区和几个几乎相同的序列基序，因此可以设计通用引物用于逆转录-定量聚合酶链反应的扩增。然而，HRV基因型的序列多样性对开发高效检测所有基因型的分子方法提出了挑战。大多数HRV RT-PCR检测以保守的5’非编码区(NCR)为目标，该区域在HRV基因型中表现出最大的序列同源性。不过即使在5’NCR中，引物和探针必须采用简并和修饰碱基或多种寡核苷酸设计，以扩增所有HRV基因型。与HRV基因组的其余部分相比，病毒衣壳蛋白的编码区表现出高度的异质性，导致了广泛的抗原多样性，因此常作为HRV基因型鉴定的靶向区域。病毒衣壳由四种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成。前三种存在于细胞表面，而VP4则存在于衣壳下方。其中VP1和VP4+VP2(VP0)衣壳区是最保守的病毒衣壳结构。

尽管通过RT-PCR对HRV进行定性检测目前足以确定HRV感染，但需要对临床样本中的HRV RNA进行准确定量，以研究HRV病毒载量与病毒传播以及患者症状和结果之间的关系。当伴随着标准曲线的扩增(RT-qPCR)时，实时RT-PCR分析可用于定量样品中的病毒拷贝数。然而，由于引物和探针序列与特定病毒序列之间的碱基错配导致的扩增效率低下，使用单一HRV引物和探针组进行定量的RT-qPCR分析可能无法对所有基因型给出准确的结果。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明根据GenBank中登录的的各种人鼻病毒序列信息，通过申请人自有引物设计体系，兼顾HRVs不同毒株间的差异，选择保守核苷酸序列作为扩增区域，针对主要感染物种HRV-A与HRV-C分别设计了一对同时检测HRVs 5’NCR和VP基因的物种特异PCR引物，并确立了有效的扩增靶序列区段。对该引物的特异性、敏感性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测人鼻病毒，特异性好，灵敏度高。得到扩增产物后，结合Nanopore测序经过分析，即可对人鼻病毒不同物种进行准确鉴定和定量。

因此，本发明的第一目的是提供一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中鼻病毒检测靶向区段；

本发明的第二目的是提供一种适于ONT测序平台的、用于感染样本中鼻病毒检测的引物组合及其试剂盒；

本发明的第三目的是提供一种基于ONT测序平台的用于感染样本中鼻病毒检测方法。

具体的，本申请的技术方案如下：