[发明专利]一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法

说明书

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法。本申请的方法，包括：构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；将表达载体质粒转化至宿主菌中，并使宿主菌诱导表达所述融合蛋白以形成包涵体；将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次离心处理，弃上清后，收集沉淀；将激活内含肽切割的缓冲液与沉淀混合孵育以激活内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的第二混合物；将第二混合物进行第二次离心处理，离心后上清为含有分子量小于3KDa的目标寡肽。本申请的寡肽合成及纯化方法，有效解决现有的寡肽生物合成方法存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大等问题。

技术领域

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法。

背景技术

寡肽在护肤、保健和医疗等领域具有重要的应用价值，但其工业化合成方式仍然是一个很大的难点。传统的短肽合成方法是基于化学反应合成技术，这种方法需要复杂的反应步骤和剧烈的反应条件，会生成大量的副产物，严重影响降低了寡肽的产量和提高了提纯的难度。这种化学合成方式往往会造成较大的环境污染和产生有毒的副产物。因此，更加环境友好和产物单一的生物合成法在寡肽制备上具有很大的优势。生物合成法利用人工构建的遗传编码信息在宿主中高效快速的产生寡肽产物，具有合成成本低、效率高、副产物少等优势。为了能够将寡肽特异性地分离提纯出来，在设计人工构建的遗传编码信息时，需要在寡肽上游加上亲和标签(如His标签或GST标签)，并在标签和寡肽序列之间加上蛋白酶切割位点。整体的流程包括蛋白表达、菌体破碎、介质富集、目标蛋白洗脱、超滤除盐浓缩、蛋白酶切割、分子筛富集纯化等多道生产工艺，这使得寡肽的生物合成法变得极为繁琐，提高了生产的损耗和成本。因此，更加方便的寡肽生物合成及分离纯化技术，在寡肽的工业化生产上，是迫切的需求。

发明内容

鉴于此，本申请提供了一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法，有效解决现有的寡肽生物合成方法存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大等问题。

本申请提供了一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法，包括：

步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；所述内含肽为产生C末端自切割的蛋白分子；

步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌诱导表达所述融合蛋白以形成包涵体；

步骤3、将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次离心处理，弃上清后，收集沉淀；

步骤4、将激活内含肽切割的缓冲液与所述沉淀混合孵育以激活所述内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的第二混合物；

步骤5、将所述第二混合物进行第二次离心处理，离心后上清为含有分子量小于3KDa的目标寡肽。

具体的，所述目标寡肽为现有常规的寡肽或短肽，如乳四肽或四肽-9等。

具体的，所述表达载体质粒可以为原核生物表达载体质粒或真核生物表达载体质粒，优选为原核生物表达载体质粒，将现有常规的原核生物表达载体质粒经过常规酶切和连接与融合蛋白结合，构建得到含有融合蛋白的表达载体质粒。

进一步的，所述原核生物表达载体质粒可以为大肠杆菌菌株表达载体质粒。

另一实施例中，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个。

具体的，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个。