[发明专利]一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用。该蛋白的编码序列如SEQIDNO.1所示，用于制备重组Fiber2蛋白，步骤为：通过密码子优化合成Fiber2基因，在Fiber2的N端融合杜氏藻碳酸酐酶N‑半结构域的前11个氨基酸残基(VSEPHDYNYEK)和His₆，利用基因装配方法，构建了pET23a‑rFiber2重组表达质粒，将重组载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中行表达，通过Ni‑NTA亲和纯化，得到重组Fiber2蛋白。本发明显著提高了重组Fiber2蛋白在大肠杆菌中的表达量和可溶性，且改进了蛋白纯化流程，减少了重组Fiber2蛋白的内毒素含量，可实现重组Fiber2蛋白的大规模发酵和生产；WesternBlot和动物实验表明重组Fiber2蛋白具备良好的免疫原性和免疫保护力，可用于制备低成本、质量可控、安全有效、能够预防高致病性FAdV‑4病毒感染的亚单位疫苗。

技术领域

本发明属于重组基因蛋白药物技术领域，具体涉及一种重组Fiber2蛋白、制备方法及应用。

背景技术

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引发心包积液综合征(HIS)的病原。该病是家禽养殖业的主要传染病之一，以心包积液和包涵体肝炎为特征。FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染会引发肌胃糜烂、心包积液及包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染等，给养鸡业造成较大损失。禽腺病毒感染事件，于1963年首次在美国发生，随后扩散至世界各地。发病鸡除3～4周龄的肉鸡外，10-20周龄的蛋鸡也可被FAdV感染。目前高致病性血清4型FAdV在鸡群中流行最广泛，致病性也最强，给养鸡业造成了最为严重的经济损失。

禽腺病毒是一种没有包膜的直径为70-90nm的颗粒，呈二十面体结构。FAdV的结构蛋白主要有：六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和位于五邻体上的纤维突起(Fiber)三种蛋白。每个五邻体上有2个纤突蛋白，其中，FAdV-A和FAdV-C由2个不同的纤突蛋白基因编码，分别称为Fiber-1和Fiber-2；FAdV-B，FAdV-D和FAdV-E的2个纤突蛋白只有一个纤突蛋白编码基因。纤突蛋白带有亚群特异性和型特异性抗原表位。

由于高致病性血清4型FAdV对养鸡业造成的巨大危害，许多研究者致力于开发能保护鸡群免于感染FAdV-4的疫苗。其中亚单位疫苗没有全病毒灭活疫苗可能造成感染扩散流行的风险，是所有疫苗中最安全的疫苗种类，同时生产成本较低，是疫苗研究的最佳方向。研究表明FAdV-4的纤突蛋白Fiber2可作为制备亚单位疫苗的抗原蛋白，然而，目前Fiber2蛋白的制备方法存在一些缺陷，未经改造的Fiber2蛋白用原核细胞表达为无生物活性的包涵体，很难将其直接制成疫苗，且产品品质不可控，免疫原性相对较差，使用后仍存在感染风险；通过Sumo融合表达的Fiber2蛋白在原核系统中可溶性表达，但极其不稳定，在纯化过程中蛋白容易降解，且Sumo标签需要通过昂贵的蛋白酶酶切去除，纯化工艺相对复杂导致Fiber2蛋白的产率很低，工业化生产成本高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组Fiber2蛋白的编码序列，同时通过所述编码序列得到一种重组Fiber2蛋白，并进一步提供所述重组Fiber2蛋白的应用，其技术方案如下：

一种重组Fiber2蛋白，重组Fiber2蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1中位于第1～7位的HIS标签氨基酸序列，位于第8～19位的杜氏藻碳酸酐酶N-半结构域的前11个氨基酸残基序列，Fiber2蛋白的氨基酸序列位于SEQ ID.NO.1中的其他位置。

进一步的，编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种包含编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列的重组Fiber2蛋白表达载体。

一种包含所述重组Fiber2蛋白表达载体的宿主细胞。