[发明专利]一种重组Fiber2蛋白、其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组Fiber2蛋白，其特征在于，所述重组Fiber2蛋白的氨基酸序列包括SEQ IDNO:1中位于第1～7位的HIS标签氨基酸序列，位于第8～19位的杜氏藻碳酸酐酶N-半结构域的前11个氨基酸残基序列，Fiber2蛋白的氨基酸序列位于SEQ ID.NO.1中的其他位置。

2.根据权利要求1所述重组Fiber2蛋白，其特征在于，其编码所述重组Fiber2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种包含如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的重组Fiber2蛋白表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述重组Fiber2表达载体的宿主细胞。

5.一种如权利要求1-2所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，通过将如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列克隆到pET23a表达载体上，得到重组Fiber2蛋白表达载体；将所述重组Fiber2表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，分离纯化，得到所述重组Fiber2蛋白。

6.根据权利要求5所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组Fiber2表达载体为pET23a-rFiber2，其制备方法如下：

(1)第一PCR扩增：根据Gene Bank:MN577985.1公布的Fiber2基因序列，进行密码子优化设计引入VSEPHDYNYEK末端同源序列，合成重组Fiber2基因作为模板，以如SEQ ID NO:3所示的F1和如SEQ ID NO:4所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到重组Fiber2线性片段；

(2)第二PCR扩增：以pET23a质粒为模板，以如SEQ ID NO:5所示的F2和如SEQ ID NO:6所示的R2为引物，进行载体PCR扩增，获得pET23a载体的线性片段；

(3)将所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增获得的重组rFbier2、pET23a载体的两个线性片段按摩尔比3：1用T5核酸外切酶进行冰水浴消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR鉴定筛选，得到pET23a-rFiber2表达载体。

7.根据权利要求5所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达步骤为：将所述重组载体pET23a-rFiber2转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到表达菌株，将所述表达菌株接种于含氨苄霉素的液体LB培养基中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1-1mM，18-37℃诱导表达4-20h。

8.根据权利要求5所述重组Fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化及内毒素去除步骤为：用含0.1％Triton X114的裂解缓冲液重悬诱导后的菌体，超声破菌，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤；Ni-NTA填料装柱，使用5倍柱体积纯水冲洗柱子除去乙醇；用5倍柱体积0.1％Triton X114的裂解缓冲液平衡柱子；过滤后的上清蛋白过柱；用5倍柱体积含0.1％Triton X114的60mM咪唑洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白及内毒素；用5倍柱体积缓冲液B洗涤柱子除去残余的Triton X114；用3倍柱体积500mM咪唑洗脱液洗脱重组Fiber2蛋白。

9.根据权利要求7所述重组Fiber2蛋白在制备疫苗中的应用。