[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，属于生物传感器技术领域。所述荧光生物传感器的组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链。该生物传感器检测范围宽至50μg/mL‑50 fg/mL，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。

背景技术

四环素在牛奶中根据食品安全国家标准(GB 31650-2019)允许的残留量为100 μg·kg^-1，在蜂蜜中根据食品安全国家标准(GB 14963-2011)允许的残留量为20 μg·mL^-1。目前用于检测四环素残留的传统方法有液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。传统检测方法需要大型仪器且耗时较长检测线较高等缺点。生物传感器方法主要有荧光适配体传感器、比色适配体传感器等；荧光适配体传感器荧光染料存在抗光漂白性差、荧光性能易受外界因素影响，比色适配体传感器金纳米粒子容易受到盐粒子的影响, 出现非特异性聚集变色现象表现出实验结果不稳定的现象；现有技术如高效液相色谱四环素检出限为0.125mg/kg，相对标准偏差在5%以内；荧光适配体传感器在最佳条件下, 四环素的检测线性范围为0.01~100 ng/mL, 检出限 (LOD) 为0.0062 ng/mL。

在四环素的检测中急需一种检测范围宽，检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定的生物传感器。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器。本发明提供的生物传感器检测范围宽（50 μg/mL-50 fg /mL），检测所需时间短、仪器便携适用于现场即时检测、实验结果稳定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器，其组成包括：四环素特异性适配体aptamer76链、trigger链、Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链；

所述的aptamer76链的碱基序列为：

5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；

所述的trigger链的碱基序列为：5’-CACGTGGAGCTCGAATTCCGTACG-3’；

所述sgRNA的碱基序列为：

5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC CGU ACG GAA UUC GCU AGU CCG AGC UCC ACG UG-3'

所述FQ链的碱基序列为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。

上述基于CRISPR-Cas系统检测四环素的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）二元复合物探针构建：所述二元复合物探针由aptamer76链与trigger链杂交而成；

（2）四环素与二元复合物探针反应：将步骤（1）所构建的二元复合物探针与四环素均匀混匀孵育；

（3）均相反应：将Cas14a蛋白、sgRNA、FQ链、四环素与二元复合物探针的混合液加入到均相中，混合均匀后孵育；

（4）荧光仪检测化学发光强度。

上述荧光生物生物传感器的制备方法中所述步骤（1）中aptamer76链与trigger链的浓度比为1.5:1。