[发明专利]一种血液游离DNA甲基化定量检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种血液游离DNA的甲基化定量检测方法及其应用，属于生物检测技术领域。该方法能够有效改善现有的基于游离DNA的甲基化肿瘤标记物的预测准确率，适用于肿瘤的早筛应用。本方法利用健康人类血液白细胞的基因组DNA甲基化率作为血液样本的甲基化值。检测待测血液样本的甲基化率后，通过减去健康血液的甲基化值并与检测到的cfDNA片段数目进行乘积，得到肿瘤细胞来源的甲基化的cfDNA片段的数目，作为cfDNA绝对甲基化值。通过对比研究发现使用cfDNA绝对甲基化值能够显著提高现有cfDNA甲基化肿瘤标记物的预测准确率。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种血液游离DNA甲基化定量检测方法及其应用。

背景技术

癌症的早期检测，在肿瘤有机会发展转移之前检测到肿瘤，是提高肿瘤病人生存的最佳策略。近些年来，大量研究表明检测血液中肿瘤来源的cfDNA是一种非侵入性，安全且有效的早期癌症的检测方法。但很多早期，甚至中晚期肿瘤患者的血液中来源于肿瘤的cfDNA水平却相对较低。因此基于cfDNA的癌症筛查的主要挑战是如何从血液中不同来源的cfDNA中识别出微量的肿瘤来源的cfDNA。

肿瘤的发生与原癌基因的激活与抑癌基因的失活密切相关，而癌症相关基因的表达与沉默往往受到表观遗传信息调控。在多种表观调控方式中，甲基化是一种非常稳定而且具体组织特异性的调控方式。研究者观察到人类正常组织癌变风险与基因组中甲基化变异程度直接相关，比如结直肠癌细胞的异常甲基化的程度相对较高。因而检测血液中的源于肿瘤cfDNA的异常甲基化对于发现早期癌症是一种可靠的方法。

在肿瘤早期，血液中来自于肿瘤细胞的cfDNA总量相对较低。大多数cfDNA都是来自于血液中碎裂的白细胞的基因组DNA。而目前常用的cfDNA甲基化水平的计算方法仅计算肿瘤和白细胞来源cfDNA混合后的甲基化水平，导致来源于肿瘤细胞的cfDNA的信号被稀释，从而影响癌症检测的灵敏度。因而针对血液中的cfDNA甲基化水平采用合适的计算方法，对于准确预测是否发生肿瘤具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的cfDNA甲基化水平计算方法准确度低、灵敏度低的技术问题，本发明目的在于提供一种血液游离DNA甲基化定量检测方法及其应用。

本发明所采用的技术方案为：一种血液游离DNA甲基化定量检测方法，所述检测方法包括：

(1)基底离体样本基因组甲基化值：获取基底离体样本基因组DNA，进行预处理；计算基底离体样本基因组中CpG位点的甲基化值，标记为A1；

(2)待测样本的甲基化值：计算待测样本的血液游离DNA中CpG位点甲基化值，标记为A2；检测待测样本的血液游离DNA片段数目，标记为A3；

(3)cfDNA绝对甲基化值：计算(A2-A1)×A3，得到cfDNA绝对甲基化值。

作为优选地，所述步骤(1)中，基底离体样本基因组为健康人类离体血液提取出白细胞的基因组样本。

作为优选地，所述步骤(1)中，预处理包括将健康人类离体白细胞基因组DNA片段打断、筛选、甲基化建库以及二代测序的处理过程。

作为优选地，所述步骤(1)中，DNA片段大小为150-200bp。

作为优选地，所述步骤(2)中，检测待测样本的血液游离DNA片段数为以二代测序法测序结果进行统计，获得每个区域的片段数目。

作为优选地，所述步骤(3)中，cfDNA绝对甲基化值为评估待测样本中肿瘤来源的发生甲基化的cfDNA的数目。

一种如权利要求1-6任一项所述的检测方法在cfDNA甲基化肿瘤标记物筛选中的应用。

作为优选地，所述筛选的标准值为获得的cfDNA绝对甲基化值。

本发明的有益效果为：