[发明专利]一种生物样本的蛋白质组学分析方法

说明书

本发明涉及一种生物样本的蛋白质组学分析方法。所述方法基于多肽同位素标记技术以及LC‑MS分析技术，包括在目标生物样本中添加信号增强样本的步骤，其中，所述信号增强样本包含目标生物样本蛋白种类的50％以上的蛋白种类，且不包含高丰度蛋白。由于无需去除待测样本的高丰度蛋白，本发明所提出的方法不会造成低丰度蛋白的损失，从而提高了待测样本中低丰度蛋白鉴定量。

技术领域

本申请属于生物化学领域，具体涉及一种生物样本的蛋白质组学分析方法，所述方法能够提高生物样本的蛋白质鉴定量。

背景技术

蛋白质组学分析是以蛋白质为基本研究对象，用系统生物学的方法，研究生物体的细胞、组织的组成和变化规律的科学。经过二十来年的发展，基于质谱的蛋白质组学以其灵敏度、准确度、自动化程度高等优点已经大规模地应用于生物医药领域的研究。

然而，在基于质谱的自下而上的(bottom-up)蛋白质组学中，质谱分析技术的发展虽然提高了样本检测的灵敏度和通量，但捕获整个蛋白质组的信息仍面临多种挑战，其中最大的挑战之一是血清和血浆中低丰度蛋白的检测。造成这个难题的原因，一方面是低丰度蛋白的检测受限于质谱仪的灵敏度；另一方面是由于高丰度蛋白的“遮蔽”。在血清和血浆样本中通常含有10000多种不同的蛋白质，最大浓度与最小浓度相差在10个数量级以上。而丰度最高的数十种蛋白质占总蛋白质含量的95％以上，在质谱分析过程中，这些蛋白质会掩盖低丰度和超低丰度蛋白质的信息。质谱分辨率的提高需要较大成本投入，短时间内难以有较大改善，因此，在样本制备过程中通常需要消除高丰度蛋白的影响，以提高低丰度蛋白定性定量结果的可靠性。

目前，消除高丰度蛋白影响的策略主要有以下几种：

(1)去除高丰度蛋白。选择性地去除高丰度蛋白是蛋白质组学的关键技术之一，方法包括超滤法、色谱分离、化学试剂沉淀提取、免疫亲和提取等。其中，基于亲和技术的分离方法选择性最好，相关的商品有Thermo Scientific的High-Select^TMTop14高丰度蛋白去除试剂盒等，可以特异性去除样本中的高丰度蛋白。这类方法虽然能够有效去除高丰度蛋白，但是在样本处理过程中，也有可能同时造成低丰度蛋白的损耗，影响低丰度蛋白的检测和准确定量，而且仅适用于已知高丰度蛋白的情况。另外一种类似的方法是富集低丰度蛋白，这种技术是采用修饰有组合六肽文库的珠子能结合不同种蛋白的原理，在复杂生物样本中，少量的低丰度蛋白被珠子结合，过量的高丰度蛋白质则因为缺少结合位点未被珠子捕获而在洗脱过程中被除去，从而有效地降低样本中蛋白的浓度差。这种方法适用于高丰度蛋白未知的情况，但同样的，在处理过程中也有可能造成低丰度蛋白的损失。

(2)样本预分级。这种方法是在样本进行LC-MS分析前，根据肽段的不同性质将样本分离成多个组分，以降低肽段的共流出效应，从而提高鉴定。根据分离原理不同分为以下几种策略：SCX(Strong Cation Exchange强阳离子交换)、SAX(Strong Anion Exchange强阴离子交换)和RPLC(Reverse Phase Liquid Chromatography反相色谱)等。这种方法虽能有效提高样本鉴定量，然而将一个样本分离成多个组分进行分析，会显著增加分析时间，影响样本分析的通量，且对于易降解的肽段不利。

总之，目前尚缺少在消除高丰度蛋白影响的同时，不造成样本损耗的蛋白质组样本制备方法。因此，需要开发一些既能高效消除高丰度蛋白影响，又能提高低丰度蛋白定性定量结果可靠性的蛋白质组学分析方法。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种生物样本的蛋白质组学分析方法，所述方法基于多肽同位素标记技术，用于高效消除样本中高丰度蛋白的影响，并提高低丰度蛋白鉴定量。

本发明中，多肽指的是蛋白质经过蛋白酶作用后产生的肽段。

本发明中，蛋白指的是待分析样本含有的蛋白质。