[发明专利]抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体及其应用

说明书

本发明涉及抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体及其应用。公开了其VHH链的框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，同时还公布了编码该单域抗体的核苷酸序列以及能够表达该单域抗体的宿主细胞。此外，本发明还公开了一种含有抗CD20的VHH结构域和抗CD3的VHH结构域的双特异性抗体，所述双特异性抗体由两条不同的单域抗体序列融合而成。本发明完整保留了抗CD20抗体和抗CD3抗体的生物学活性，能够识别肿瘤细胞和效应细胞，并将效应细胞靶向到肿瘤细胞，促使效应细胞显著发挥杀伤作用。本发明可以用于治疗B细胞淋巴瘤药物的研发。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，尤其涉及抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体及其应用。

背景技术

B细胞淋巴瘤是一种来源于淋巴组织有不同临床表现的异质性淋巴增生性疾病。它包括从缓慢增长的霍奇金淋巴瘤(HD)，到更具侵略性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。最近这些年，患非霍奇金淋巴瘤的人数不断增多，发病率也在不断攀升。在这些非霍奇金淋巴瘤(NHL)病例中，有85％以上为B细胞疾病。同时据研究表明，95％以上B细胞淋巴瘤均异常高度表达CD20。

CD20分子又称为B淋巴细胞表面抗原B1、跨膜4结构域亚家族A成员1和MS4A1，它是一种B淋巴细胞表面的特异性膜蛋白，以非糖基化形式存在。该抗原表位表达于前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞中而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他组织中。人CD20共由297个氨基酸组成，其相对分子量为33-35kDa。CD20分子有四个跨膜结构域，包括两个胞外环和胞内区域。经研究证明，第三、四跨膜区的47个氨基酸外环为CD20的抗原表位，被大多数抗CD20抗体所识别。CD20蛋白没有已知的天然配体干扰其与抗体的结合，并且CD20与抗体结合后无显著内化和脱落也不因与抗体结合而发生抗原调变,从而成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。

目前，经过批准上市的CD20靶点抗体类药物，利妥昔单抗—美罗华(rituximab)获得较大的市场占有率，奥法木单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗也分别在2009、2013、2017年上市，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。靶向CD20抗体的抗肿瘤活性主要包括诱导凋亡作用、补体依赖的细胞毒性作用(Complement dependent cytotoxicity，CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)。单克隆抗体将继续用于多种癌症的治疗。然而，由于其分子量较大，携带四个多肽链，限制了它们接近肿瘤靶标。

抗体药物，特别是基因工程抗体药物作为被动免疫制剂在疾病的诊断、预防和被动免疫治疗中显示出了非常好的应用前景。特别是近年发现的骆驼科动物体内天然缺失抗体轻链和CH1区的“单域重链抗体”(VHH)是目前研究的热点之一。由于此种单域重链抗体VHH的分子量只有普通单克隆抗体的1/10，大小仅为2-5nm，也被称为单域抗体(Singledomain antibody，sdAb)，或纳米抗体(Nanobody，Nb)。重链可变区的长CDR3区可以形成一个稳定的凸起环结构，该结构中的稳定的二硫键可以穿透抗原的内部，与普通抗体与抗原形成的凹形拓扑结构相比，VHH抗体与抗原的亲和力更高。sdAb可用于显示传统免疫球蛋白的隐藏表位，使其在免疫研究、诊断检测、医学和生物成像以及治疗性抗体开发等领域取得了广泛的应用。

但目前尚未有针对B细胞淋巴瘤的CD20分子的单域抗体的报道。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供抗人B淋巴细胞表面抗原CD20的单域抗体，单域抗体VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR；