[发明专利]一种胆汁转化物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种胆汁转化物及其制备方法，属于生物工程技术领域。该制备方法通过将工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液经过吸附、除杂、超滤浓缩后与缓冲液混匀，调节pH后加到离子交换琼脂凝胶柱中进行酶的固定化，制得固定化酶柱；将禽胆精制液与NADP+混合，调节pH后流加至固定化酶柱进行转化，取清液经减压浓缩、真空干燥后制得胆汁转化物。本发明以离子交换琼脂凝胶柱作为羟基类固醇脱氢酶固定化的载体，稳定性好、机械强度高、载量大，酶分子不易脱落，可连续反应且反应产物能够及时与酶分离，减少逆反应的发生，从而得到TUDCA：TCDCA比例更高的胆汁转化物。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种胆汁转化物及其制备方法。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，化学名称为3α,7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸，对胆结石及肝病具有明显的疗效。因此含TUDCA的胆汁转化物在保肝护胆方面有重要意义和广阔的应用前景。胆汁转化物传统的制备方法一般主要是化学合成法，近年来随着酶催化的发展，出现了一些酶催化制备的胆汁转化物。但是，酶蛋白分子对反应条件较为敏感，稳定性较差，容易失活，从而导致其催化能力的降低；而用生物技术的方法生产酶导致成本较高，并且难以回收和重复使用，这些不足大大限制了酶在工业上的大规模应用。中国发明专利CN202010469657.8以酶菌体菌悬液或者菌体破碎后的上清液进行生物转化，此方法将菌体直接与原料长时间接触，后续需要除杂步骤，而且很难保证菌体和其碎片以及其内部的外源DNA、蛋白质以及内毒素的有效去除，此外酶包裹在菌体内部会影响酶和底物的接近，从而影响转化效率。中国发明专利CN201410588581.5，以禽畜胆汁直接冷冻干燥制得的禽畜胆粉为原料，用壳聚糖固定化的7α-羟基类固醇脱氢酶和固定化的7β-羟基类固醇脱氢酶进行生物转化，此方法需要将生物转化所用到的酶固定到壳聚糖载体上制成固定化酶柱，而壳聚糖作为载体存在机械强度差、酶载量小、酶活性低和非特异性吸附等问题，同时在连续反应操作过程中容易发生破裂而导致酶脱落，影响催化效果的同时不利于反复使用，破裂后与产物混在一起很难分离，并且在对酶进行固定化处理之前，酶的纯化步骤复杂且成本高、酶活不易保持等问题，使得工艺难以放大，严重影响了制备效率，无法满足市场需求。也有一些专利利用重组蛋白的组氨酸标签与金属离子亲和层析树脂结合、或离子交换树脂来制备固定化酶，但是金属离子亲和层析树脂上的金属离子结合力较差、载量较低、易脱落，不利于重复利用，且脱落后污染产物不易分离；而离子交换树脂一般只适合氨基酸等。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种胆汁转化物的制备方法，该制备方法通过以离子交换琼脂糖凝胶作为羟基类固醇脱氢酶固定化的载体，稳定性好、机械强度高、载量大，酶分子不易脱落，可连续反应且反应产物能够及时与酶分离，减少逆反应的发生，从而得到TUDCA：TCDCA 比例更高的胆汁转化物。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种胆汁转化物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、固定化酶的制备：

向工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液中加入质量分数为0.5～2％的活性炭，充分混匀0.5～1h，离心或过滤去除杂质，收集第一含酶清液并超滤浓缩，加入终浓度为20～100mM的缓冲液混匀，得到第二含酶清液，调节第二含酶清液的pH为7.5～9.0；将第二含酶清液加样至离子交换琼脂糖凝胶柱，弃去流穿液，用缓冲液清洗，得到7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱；

S2、禽胆精制液的制备：

对禽胆破碎取汁，过滤、浓缩，加入乙醇混匀后过夜，离心或过滤去除沉淀，清液浓缩至无醇味，得到禽胆精制液；

S3、胆汁转化物的制备：