[发明专利]一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的电化学/比色双模式检测GP73的方法

说明书

本专利提供一种基于H‑rGO‑Mn₃O₄纳米酶的电化学/比色双模式传感器检测高尔基体蛋白73（GP73）的方法，采用纳米金粒子（Au NPs）修饰丝网印刷电极，将GP73适配体（Apt）的互补链（cDNA）固定在电极表面；将Apt固定H‑rGO‑Mn₃O₄纳米酶表面作为检测探针；利用cDNA和GP73与检测探针之间的竞争作用，采用3,3',5,5'‑四甲基联苯胺（TMB）作为电化学和比色的双功能探针，利用纳米酶催化信号放大方式，构建了基于H‑rGO‑Mn₃O₄纳米酶的电化学/比色双模式适配体传感器，实现了对GP73的双信号检测，最低检测限为0.1 pg/mL。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于复合纳米酶材料检测GP73的方法。

背景技术

高尔基体蛋白73（GP73）是一种存在于高尔基体的跨膜糖蛋白，相对分子量为73kDa。GP73检测的常用方法为酶联免疫吸附测定法（ELISA）。公开号为CN 111378627 A的发明专利，涉及一种使用单克隆抗体的试剂盒检测血清中GP73的方法，但该方法所用试剂盒操作时间长，至少40小时，且单克隆抗体保存条件苛刻，需要特定的保存环境。公开号为CN 113533734 A的发明专利，涉及一种基于磁微粒化学发光法平台制备的试剂盒检测GP73的方法，但该方法使用了碱性磷酸酶对抗体进行标记，增加了制作成本。因此，需要建立一种低成本，快速、操作简便的GP73检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于血红素-还原氧化石墨烯-四氧化三猛（H-rGO-Mn₃O₄）纳米酶构建电化学/比色双模式适配体传感器检测GP73的方法。

为了解决该技术问题，利用还原氧化石墨烯（rGO）的高比表面积和高电子转移效率、氯化血红素（Hemin）的过氧化物酶性能以及纳米四氧化三猛（Mn₃O₄）粒子的优异催化性能，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的H-rGO-Mn₃O₄纳米酶。H-rGO-Mn₃O₄纳米酶用于固定氨基功能化的GP73适配体（Apt），形成H-rGO-Mn₃O₄-Apt检测探针。纳米金（AuNPs）装饰在丝网印刷电极（SPE）表面以捕获Apt的补链cDNA，cDNA与H-rGO-Mn₃O₄-Apt互补形成双链结构。当GP73存在时，Apt特异性识别GP73，使得双链结构裂解，部分Apt与GP73形成共轭物从电极表面脱落。电极表面的H-rGO-Mn₃O₄纳米酶催化分解H₂O₂，产生氧气（O₂），使得3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）被氧化为oxTMB，从而实现对GP73的电化学检测。另一方面，将少量离开电极表面H-rGO-Mn₃O₄以及Apt-GP73共轭物收集在试管中，在H₂O₂作用下，H-rGO-Mn₃O₄纳米酶催化氧化底物TMB成oxTMB，使得体系由无色变成蓝色，从而实现GP73的可视化比色检测。因此基于GP73和cDNA与H-rGO-Mn₃O₄-Apt之间的竞争关系实现了GP73的电化学/比色双模式检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：血红素-还原氧化石墨烯-四氧化三猛（H-rGO-Mn₃O₄）纳米酶的制备

（1）还原氧化石墨烯（rGO）的制备

称取氧化石墨烯（GO）置于超纯水中，破碎溶解；随后加入抗坏血酸（AA），搅拌还原，得 rGO溶液。