[发明专利]一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的电化学/比色双模式检测GP73的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的基于血红素-还原氧化石墨烯-四氧化三猛H-rGO-Mn₃O₄纳米酶的电化学/比色双模式检测GP73的方法，按以下步骤进行：

步骤1：H-rGO-Mn₃O₄纳米酶的制备

（1）将还原性氧化石墨烯rGO与血红素Hemin以1:1比例混合，水浴反应，离心洗涤，得到H-rGO纳米复合材料；

（2）在超纯水中加入氯化锰MnCl₂·4H₂O粉末和聚乙烯吡咯烷PVP，室温下搅拌均匀；加热，搅拌条件下加入NaOH溶液，搅拌，离心，洗涤，得到Mn₃O₄溶液；

（3）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS添加到H-rGO溶液中，在室温搅拌条件下添加Mn₃O₄溶液，搅拌，离心，洗涤，得到H-rGO-Mn₃O₄纳米酶；

步骤2：H-rGO-Mn₃O₄-Apt检测探针的制备

取GP73适配体Apt和H-rGO-Mn₃O₄纳米酶溶液超声震荡混合，孵育，离心，洗涤，得H-rGO-Mn₃O₄-Apt检测探针；

步骤3：电化学/比色双模式传感界面的构建

（1）丝网印刷电极SPE在置放在H₂SO₄溶液，采用循环伏安法CV扫描，冲洗，干燥，得到活化的SPE；

（2）将活化后的SPE置于氯金酸HAuCl₄溶液中，采用i-t技术进行恒电位沉积，洗涤，吹干，得到Au NPs/SPE；

（3）在Au NPs/SPE表面滴加EDC/NHS溶液进行活化；

（4） 在Au NPs/SPE表面上滴加补链适配体cDNA溶液，孵育，洗涤，吹干，得到cDNA/AuNPs/SPE；

（5）将牛血清白蛋白BSA溶液添加到cDNA/Au NPs/SPE表面，孵育，已阻断非特异性结合位点，洗涤，吹干；

（6）滴加H-rGO-Mn₃O₄-Apt检测探针溶液到cDNA/Au NPs/SPE表面，恒温孵育，洗涤，吹干备用；得到H-rGO-Mn₃O₄-Apt/cDNA/Au NPs/SPE传感界面；

步骤4：电化学/比色双模式检测GP73的工作曲线绘制

（1）在步骤3得到的电化学传感界面上滴加GP73标准溶液，孵育，洗涤，吹干，得到GP73/H-rGO-Mn₃O₄-Apt/cDNA/Au NPs/SPE工作电极；并将洗涤液收集于试管中；

（3）将所制备好的工作电极置入包含H₂O₂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB的PBS缓冲液中，采用方波伏安法SWV进行扫描，记录传感器的响应电流值；将H₂O₂+TMB混合液滴加在洗涤液中，反应，采用紫外分光光度计在500 nm-800 nm波长内进行扫描，并记录652 nm处的吸光度值；

（4）分别对不同浓度的GP73进行检测，记录传感器的峰电流与吸光度值，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；

步骤5：实际人血清样本中GP73的检测

（1）将实际人血清样本滴加在步骤3制备的传感界面上，孵育，洗涤，得到工作电极，晾干备用；并收集洗涤液于试管中；

（2）将工作电极放入包含H₂O₂和TMB的PBS缓冲液中，采用SWV技术和紫外分光光度计进行扫描，记录传感器的电流响应值与吸光度值；

（3）根据步骤3所得的工作曲线，计算待测实际血清样本中GP73的浓度。