[发明专利]一种靶向CD155的CAR结构设计及其应用

权利要求书

1.一种靶向CD155的CAR结构设计，其特征在于，该CAR序列包括依次连接的人源TIGIT胞外区序列、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子，具体结构式分别命名为：CD155-28z-CAR或者CD155-BBz-CAR；具体如下：

（1）CD155-28z-CAR结构：

包括依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段CD8Hinge、人CD28分子跨膜区与胞内区CD28、人CD3z分子胞内区CD3z；其蛋白总长为367个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

（2）CD155-BBz-CAR结构：

包括依次连接的：人CD8a分子信号肽CD8a、人源TIGIT胞外区、人CD8a分子柔性片段CD8Hinge、人41BB分子跨膜区与胞内区41BB、人CD3z分子胞内区CD3z；

CD155-BBz-CAR蛋白序列，包括341个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述靶向CD155的CAR结构在制备抗肿瘤相关药剂中的应用。

3.利用权利要求1所述靶向CD155的CAR结构所构建的慢病毒表达载体，其特征在于，通过如下步骤构建获得：

（一）CAR结构制备

按照SEQ ID No.1所示CD155-28z-CAR结构序列、或者按照SEQ ID No.2所示CD155-BBz-CAR结构序列，制备获得对应的DNA编码序列；

（二）构建获得重组慢病毒表达质粒

以pCDH-EF1-MSC-T2A-GFP质粒为载体，通过酶切、连接方式，将步骤（一）中的编码序列插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，以构建获得重组后慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz。

4.权利要求3所述慢病毒表达载体在在制备抗肿瘤相关药剂中的应用。

5.权利要求3所述利用靶向CD155的CAR结构所构建的慢病毒表达载体在制备CAR-T细胞中应用，其特征在于，具体应用方法包括如下步骤：

（一）慢病毒包装

具体包装操作如下：

以293T细胞为包装细胞，将pCDH-EF1-CAR-CD155-28z或pCDH-EF1-CAR-CD155-BBz表达质粒与包装质粒pSPAX2与pMD2.G混合，对293T细胞进行转染、培养后，收集上清，用于后续T细胞感染；

（二）T细胞纯化与感染；

采集健康人外周血，经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞；

利用T细胞分离试剂盒获得纯化的CD³⁺T细胞，并加入CD3/CD28磁珠活化；

活化后，加入步骤（一）所制备病毒上清与polybrene进行孵育以感染T细胞；

孵育结束后，清洗T细胞，并加入培养基扩增T细胞；

（三）检测和扩增

对步骤（二）中感染后T细胞进行扩增培养后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测，检测合格后，进一步对转染后对CAR-T细胞进行体外扩增增殖。