[发明专利]一种多种维生素D类似物检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种多种维生素D类似物检测试剂盒，包括样本稀释液母液和检测卡，检测卡由外壳和检测条组成，检测条包括PVC底板，PVC底板上面依次粘有吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其特征在于，所述样本稀释液母液中含有荧光微球标记脂溶性小分子，所述荧光微球与脂溶性小分子之间通过短碳链偶联：活化荧光微球的羧基，使其与短碳链的氨基反应，进而将短碳链偶联到荧光微球上；继续活化荧光微球上偶联的短碳链的羧基，使其与脂溶性小分子的氨基反应，将脂溶性小分子偶联到短碳链上；

所述检测线位置包被有所述脂溶性小分子的抗体；

所述脂溶性小分子为25羟基维生素D3-3-氨基醚或25羟基维生素D2-3-氨基醚；

所述维生素D类似物为维生素D3、1，25-二羟维生素D3、24，25-二羟维生素D3、25羟基维生素D2、维生素D2、1，25-二羟维生素D2、24，25-二羟维生素D2。

2.根据权利要求1所述的多种维生素D类似物检测试剂盒，其特征在于，所述短碳链为包括4-10个碳的短链。

3.根据权利要求2所述的多种维生素D类似物检测试剂盒，其特征在于，所述短碳链为γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸或10-氨基癸酸的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的多种维生素D类似物检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液母液的制备方法包括：

（1）活化荧光微球的羧基，使其与短碳链的氨基反应，进而将短碳链偶联到荧光微球上；

（2）继续活化步骤（1）获得的荧光微球上偶联的短碳链的羧基，使其与脂溶性小分子的氨基反应，将脂溶性小分子偶联到短碳链上，进而形成荧光微球-短碳链-脂溶性小分子结构；

所述样本稀释液母液的制备方法还包括：a.采用封闭剂封闭所述荧光微球-短碳链-脂溶性小分子结构标记过程中剩余的羧基活化位点，所述质控线位置包被对应的封闭剂抗体；和/或，b.所述活化是通过添加EDC和NHS溶液反应完成的。

5.根据权利要求4所述的多种维生素D类似物检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液母液的制备方法包括：

（1）每1mL荧光微球中加入200uL 质量百分比浓度为1-5%的EDC、200uL质量百分比浓度为1-5%的NHS，震荡1-5小时，10000×g离心30min；

（2）取沉淀用复溶液复溶到1mL，加入1-30mg短碳链，震荡1-5小时，10000×g离心30min；

（3）取沉淀用复溶液复溶到1mL，加入200uL质量百分比浓度为1-5%的EDC，200uL质量百分比浓度为1-5%的NHS，震荡1-5小时，10000×g离心30min；

（4）取沉淀用复溶液复溶到1mL，加入1-30mg 25羟基维生素D3-3-氨基醚或25羟基维生素D2-3-氨基醚，震荡1-5小时，加入质量百分比浓度为10%BSA 100uL，震荡30min，10000×g离心30min，沉淀用0.01mol/L pH值为7.0±1磷酸缓冲液复溶到10mL，作为样本稀释液母液；

所述复溶液为含万分之一体积的tween-20的0.01mol/L磷酸缓冲液。

6.根据权利要求5所述的多种维生素D类似物检测试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜检测线位置包被有1mg/ml的25羟基维生素D3抗体或25羟基维生素D2抗体，质控线位置包被有1mg/ml BSA抗体。

7.一种多种维生素D类似物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用磷酸缓冲液对权利要求1-6任一项所述的试剂盒中的样本稀释液母液进行稀释作为样本稀释液；

（2）将样本稀释液与待测样品按9:1的比例混合；

（3）将混合后的样品加入权利要求1-6任一项所述的试剂盒的检测卡样品垫上的加样孔位置中；

（4）15min后，放入荧光免疫分析仪里面检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下一项或多项：

（1）用0.01mol/L pH值为7.0±1磷酸缓冲液对样本稀释液母液进行100倍稀释作为样本稀释液；

（2）通过检测不同浓度的各类型的维生素D类似物标准品的信号值，获得浓度值和信号值的标准曲线，导入到荧光免疫分析仪里面；

（3）所述荧光免疫分析仪为PMDT9000荧光免疫分析仪。