[发明专利]一种基于CRISPR Cas13d检测心肌肌钙蛋白I的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR Cas13d基因编辑蛋白检测急性心肌梗死标志物cTnI(心肌肌钙蛋白I)的方法。样品先于酶标板上孵育形成抗体‑cTnI复合物，两条ssDNA退火形成带有T7启动子序列的双链cTnI DNA适配体，适配体与cTnI‑抗体复合物孵育，结合形成抗体‑cTnI‑适配体三元夹心结构。该结构可被T7 RNA聚合酶识别并转录表达激活子RNA，并可被CRISPR Cas13d‑crRNA复合物识别，激活产生的侧切活性可有效切割RNA荧光报告分子产生一定的荧光信号。本发明首次基于Cas13d基因编辑蛋白应用于心肌标志物cTnI的精准检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术，特别涉及CRISPR Cas13d基因编辑蛋白体外检测心肌肌钙蛋白I的一种荧光检测方法。

背景技术

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是一种临床常见的心脏疾病，病因是心肌缺血性坏死造成急性冠状动脉闭塞和血流中断。因其较高的致死率和危害性，AMI的准确诊断具有相当重要的临床价值。目前监测AMI的特异性心肌标志物有肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)。其中cTnI的心肌特异性最优，且在AMI发生后，心肌组织中的心肌肌钙蛋白I(cTnI)被迅速的释放到血液中并能保持5-10天的时间窗口，因而可作为心脏损伤前筛查，也是AMI诊断最有效的途径之一。通常认为cTnI在血液中的浓度大于0.5ng/ml时出现心肌损伤，AMI患者血液cTnI通常在1-25ng/ml的范围内。

目前的cTnI检测方法包括化学发光免疫分析(CN111308099A)、酶联免疫吸附(ELISA)法、胶体金法、放射免疫测定法和化学发光法等。ELISA作为一种成熟的商用检测方式，常用的检测方式为抗体-待测分子-抗体的三明治夹心结构的一种比色检测方式，但受限于高昂的检测成本，目前亟需开发一种较为低廉的心肌标志物的检测方法。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是古细菌进化出的一套RNA引导的适应性免疫系统，可实现特定靶标核酸序列的识别、锚定和切割。CRISPR-Cas基因编辑系统已经在基因组编辑、药物递送、基因治疗、体外核酸诊断等领域实现了较为广泛的应用。CRISPR Cas基因编辑系统包含基因靶向性的crRNA和Cas蛋白，当两者形成核糖核酸复合物时可靶向特定的核酸序列并激活Cas蛋白的核酸酶切活性。其中，Cas13d是Cas系统中一类靶向RNA的Cas蛋白，具有脱靶效率低、蛋白结构紧凑等特点，相较于其他Cas蛋白没有RNA侧翼序列的要求，因而可以靶向任何RNA，故适用的范围更广。但是Cas13d目前的主要应用于细胞内mRNA沉默，其体外检测应用尚未开发。核酸适配体(Aptamer)是一段特殊的DNA或RNA核酸序列，通常是基于体外筛选技术对于特定靶标分子具有高度亲和性，相较于抗体成本更低。通过核酸适配体和Cas13d的结合可实现一些非核酸靶标的检测的可能。

当前尚未见CRISPR Cas13d与适配体相结合的用于检测cTnI的技术报道。

cTnI目前较为成熟的检测方法为ELISA法，但是其检测成本较高，对应的灵敏度较差。Cas13d作为一种紧凑的Cas蛋白酶，因其较小的结构，可导入腺病毒载体，从而达到体内递送敲低mRNA的目的。但是其体外的检测应用尚无许多报道，目前没有基于Cas13d检测非核酸分子的文献报道。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种精准的基于CRISPR Cas13d检测心肌肌钙蛋白I的方法。

本发明方法将非核酸分子信号输入转换为可被Cas13d识别的核酸分子信号，在cTnI ELISA检测的基础上，通过改变一些元件，降低cTnI的检测限和检测成本。

技术方案：本发明提供一种基于CRISPR Cas13d检测心肌肌钙蛋白I的方法，包括如下步骤：