[发明专利]一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用

说明书

本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，为避免慢病毒生产细胞培养过程中使用成分不明的培养基组分和动物来源的生产物料，本悬浮驯化方法流程简便，驯化时间短，成本较低；采用无血清培养基成分明确，安全风险可控，减少了工艺杂质，质量控制相对简单；生产工艺易于放大，对人力耗费较低；经扩大培养驯化所得悬浮细胞建立悬浮细胞原始细胞库(PCB)、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)，使用该悬浮系统工作细胞库(WCB)应用于慢病毒制备与生产，慢病毒粗毒液产量至少可达1‑10*10⁷TU/mL。

技术领域

本发明涉及慢病毒技术领域，特别涉及一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。

背景技术

慢病毒的生产工艺流程中粗毒液的收获，通常以HEK293T为包装细胞，使用含血清的混合培养基，在培养瓶或细胞工厂中贴壁培养，通过质粒瞬时转染的方式进行病毒包装。该方法技术相对成熟，操作简单易行，为很多实验室采用。然而，使用动物来源的血清，增加了外源病毒因子污染的风险；血清成分复杂，组分不明确，不符合药品生产注册的监管精神；血清引入的牛血清白蛋白，增加了纯化工艺和质量控制的难度；使用贴壁细胞包装慢病毒，工艺难以放大，产量难以提升，成本难以下降，且对劳动力消耗巨大；消化贴壁细胞使用动物来源的胰蛋白酶，可能引入外源病毒因子，增加质控难度等等问题。

发明内容

本发明提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用，其目的是为了解决现有技术中上述问题。

为了达到上述目的，本发明的实施例提供了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用。

本发明的第一方面涉及了一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其包含如下步骤：

步骤一：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15-30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，细胞密度1-10*10^4cells/mL，细胞总数为1-10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

步骤二：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

步骤三：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5-15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

步骤四：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养48-96h；

步骤五：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共20-40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-72h；

步骤六：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共100-300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；