[发明专利]一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用

权利要求书

1.一种HEK293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：复苏一株HEK293T工作库细胞，用HEK293CD培养基重悬细胞，总体积15-30mL，添加谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，细胞密度1-10*10^4cells/mL，细胞总数为1-10*10^6个；T75或T175细胞培养瓶培养，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

S2：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

S3：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，添加7.5-15mL HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，于37℃，5％CO₂培养箱静置20-30h；

S4：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管轻缓吹打，使细胞成单个悬浮状，将细胞转入Y125或Y250摇瓶中，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养48-96h；

S5：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，用移液管收集细胞悬液离心弃上清添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共20-40ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-72h；

S6：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率，转移细胞悬液至Y250ml或Y500培养瓶中，添加HEK293CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，共100-300ml，使细胞成单个悬浮状态继续培养，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S7：观察细胞并取样计数，记录细胞密度与活率：此时细胞应大部分成单个细胞，仅有少部分细胞小团，细胞密度应在1-3*10^6cells/mL，活率应在95％以上；收集细胞悬液分成两份：第一份细胞用终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存初步驯化细胞；第二份细胞用于下一步骤的继续驯化，用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，工作体积20-40mL，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S8：取继续驯化细胞观察并计数，记录细胞密度与活率，并用HEK293 CD培养基和谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM稀释至密度至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S9：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-48h；

S10：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1:2混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05、HEK293CD培养基配制驯化培养基，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S11：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，继续培养24-72h；

S12：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S13：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，按1:1混合SMM293TII培养基、OPM-293CD05配制驯化培养基并加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S14：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S15：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；用OPM-293CD05培养基加入谷氨酰胺使其终浓度为2-6mM，将细胞稀释至1-10*10^5cells/ml，于37℃、100-150rpm、5％CO₂震荡培养箱培养24-48h；

S16：观察细胞是否有结团并取样计数，记录细胞密度与活率，此时细胞应无结团现象，细胞活率应在95％以上；收集细胞悬液离心弃去上清，按生产规模所需细胞密度，终浓度5-10％DMSO冻存液，冻存成功驯化细胞，此时为悬浮细胞原始细胞库(PCB)。