[发明专利]一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法

说明书

本发明公开了一种使PK‑15细胞形成团块和传代培养的方法，具体步骤为：先对PK‑15细胞进行复苏，再进行细胞传代，然后配制特定的悬浮培养基，将PK‑15细胞与悬浮培养基混合倒入摇瓶中，再将摇瓶置于摇床进行悬浮培养，悬浮培养一段时间后再取样观察细胞生长状况，进行细胞计数，再进行细胞传代，得到团块状细胞，继续对团块状细胞进行细胞传代；连续传代并观察PK‑15细胞状态，得到成球形团块状的PK‑15细胞。本发明的培养方法在在不进行细胞驯化和基因改造的情况下，能直接悬浮PK‑15细胞，使得PK‑15细胞形成球形团生长，球形团块直径为20～80μm，还能够连续传15代以上。

技术领域

本发明涉及PK-15细胞培养的技术领域，具体涉及一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法。

背景技术

细胞培养对于整个生物工程技术是一个必不可少的过程，尤其在研究细胞苗、药物筛选等方面作用更加突出。传统细胞培养是通过转瓶或扁瓶培养细胞，然后发展到生物反应器使用片状载体或球形微载体高密度培养细胞，或通过中空纤维的方式培养细胞。虽然，微载体广泛用于生物制品行业，但是由于我国微载体制造技术不成熟，还不能运用于生物反应器细胞高密度培养。国内使用的微载体均为进口产品，但是进口微载体通常存在价格高的问题，给我国生物制品的发展带来了极大的影响，尤其是兽用生物制品的发展。这些细胞培养的方法均存在一些缺陷，例如：转瓶或扁瓶培养细胞的细胞密度低，平均密度仅仅为(1～5)×10⁵个/mL级别；而生物反应器或中空纤维细胞密度能够达到(2～8)×10⁶个/mL级别，甚至更高。而目前通过细胞基因改造或者驯化等方法使细胞不需要贴壁生长而直接进行单细胞悬浮培养。目前，已经能够进行悬浮培养的细胞有BHK-21、SP20、MDCK等细胞。

PK-15细胞是由Stice·E建系于1955年；PK-15细胞是PK-1a细胞的克隆系，PK-15细胞可用于多种病毒的增值及特性研究，例如猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病病毒等。但是采用传统技术培养PK-15细胞在扩大工艺困难、载体成本高等问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，在不进行细胞驯化和基因改造的情况下，直接悬浮培养PK-15细胞成球形细胞团，并能够持续传代15代以上。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，包括以下步骤：

1)将PK-15细胞进行复苏和传代；

2)配制悬浮培养基，悬浮培养基包括蛋白质小肽、胎牛血清、血清替代物、细胞因子EGF、细胞因子TGF、细胞因子M-CSF、甲基纤维素、非必需氨基酸溶液和胶原蛋白；

3)消化并计数步骤1)中传代后的PK-15细胞，然后加入步骤2)所得的悬浮培养基，再转移至摇瓶；

4)将步骤3)所得的摇瓶放入摇床中，进行悬浮培养；

5)悬浮培养后，取样观察PK-15细胞生长状态，进行细胞计数，再进行细胞传代，得到团块状细胞；

6)对团块状细胞进行细胞传代；

7)连续传代并观察PK-15细胞状态，得到类似球形团块状的PK-15细胞。

进一步，步骤1)中，PK-15细胞进行复苏时选用含有胎牛血清的DMEM培养基。

再进一步，步骤1)中，PK-15细胞传代的比例为1：3。

进一步，步骤1)中，PK-15细胞进行传代直至细胞量为(0.2～8)×10⁸个，优选为(2～8)×10⁸个，最优选为(3～8)×10⁸个。