[发明专利]一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法

权利要求书

1.一种使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将PK-15细胞进行复苏和传代；

2)配制悬浮培养基，悬浮培养基包括蛋白质小肽、胎牛血清、血清替代物、细胞因子EGF、细胞因子TGF、细胞因子M-CSF、甲基纤维素、非必需氨基酸溶液和胶原蛋白；

3)消化并计数步骤1)中传代后的PK-15细胞，然后加入步骤2)所得的悬浮培养基，再转移至摇瓶；

4)将步骤3)所得的摇瓶放入摇床中，进行悬浮培养；

5)悬浮培养后，取样观察PK-15细胞生长状态，进行细胞计数，再进行细胞传代，得到团块状细胞；

6)对团块状细胞进行细胞传代；

7)连续传代并观察PK-15细胞状态，得到团块状的PK-15细胞。

2.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤1)中，PK-15细胞进行复苏时选用含有胎牛血清的DMEM培养基。

3.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤1)中，PK-15细胞传代的比例为1：3。

4.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤1)中，PK-15细胞进行传代直至细胞量为(0.2～8)×10⁸个。

5.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤2)中，所述悬浮培养基包括以下原料：5～15mL蛋白质小肽、2～4mL胎牛血清、2～5mL血清替代物、细胞因子EGF、细胞因子TGF、细胞因子M-CSF、甲基纤维素、0.5～2mL非必需氨基酸溶液和2～50mg胶原蛋白，再加入水补足100mL；其中，细胞因子EGF的浓度为1～10ng/mL、细胞因子TGF的浓度为1～10ng/mL、细胞因子M-CSF的浓度为1～10ng/mL、甲基纤维素占悬浮培养基总质量的0.01～0.3％。

6.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤3)中，加入25～45mL步骤2)所得的悬浮培养基，再转移至总体积为125mL的摇瓶中。

7.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤4)中，将步骤3)所得的摇瓶放入摇床中，然后加入二氧化碳培养箱中，在35～40℃下进行悬浮培养；其中，控制摇瓶的转速为90～140rpm/min。

8.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤5)中，悬浮培养24h、48h和72h后，分别取样观察细胞生长状况。

9.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤5)中，细胞悬浮培养48～72h后，进行细胞传代，细胞传代比例为1：(2～3)。

10.如权利要求1所述的使PK-15细胞形成团块和传代培养的方法，其特征在于，步骤6)中，团块状细胞的细胞传代方法为：摇瓶静置10～20min，然后吸取培养液，然后加入5-10mLPBS溶液，混匀后静置10～20min，然后吸取PBS溶液，重复使用PBS溶液洗涤1～3次，最后加入0.5～2mL浓度为0.25％的EDTA胰酶消化并吹散，再按照1：(2～3)的比例进行细胞传代。