[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法

说明书

本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法，属于基因检测领域。该双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；发光探针位于FIP上，在FIP序列的5’端标记有荧光发光基团，淬灭探针与F1C的序列互补，淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团。LAMP检测冻干微球包括这种双链检测探针，该冻干微球及检测方法，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16‑23sRNA为检测靶标，采用双链探针‑恒温变色体系，可兼具荧光定量PCR图谱分析及肉眼观察法来判读结果，探针特异性强，变色颜色对比明显，不易产生误判，双重体系互相映照，检测的准确性高。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的 LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法。

背景技术

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性短杆菌、两端钝圆，无牙孢，有鞭毛，在自然界分布广泛。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为兼性厌氧，易在食品表面生长。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可以产生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不耐高温，很容易被高温杀死，但是它所产生的“米酵菌酸”毒素耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性。

目前常用的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测方法包括显色培养基培养法、荧光定量PCR、LAMP恒温PCR法等，均可以有效地检测。但显色培养法存在耗时长、人为因素大等缺点，检测一个样本往往需要一周，还存在结果不一致性等缺陷。荧光定量PCR通量大，检测时间短，只需要2-4小时，但需要精密昂贵的仪器及专业检测人员，成本高，不利于推广。LAMP环介导恒温扩增法借助 6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，该方法目前因其设备简单、检测时间短已广泛应用到病原菌检测领域。

环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料SYBR GREEN，通过荧光PCR仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的双链DNA结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。

发明内容

本发明针对现有环介导恒温扩增法结果判读上的缺陷，提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法，其针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16-23sRNA保守序列设计引物组和双链检测探针，能够快速、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，灵敏度高，特异性强，且不易出现假阳性。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；

发光探针位于内引物FIP上，在所述内引物FIP序列的5’端标记有荧光发光基团，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

淬灭探针与内引物FIP的5’端前20个序列互补，所述淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述荧光发光基团包括FAM、VIC、 TET；

荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ。

第二方面，本发明提供一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，冻干微球中含有如权利要求1或2的LAMP双链检测探针。