[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针、冻干微球及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述双链检测探针包括发光探针和淬灭探针；

发光探针位于内引物FIP上，在所述内引物FIP序列的5’端标记有荧光发光基团，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

淬灭探针与所述内引物FIP的5’端前20个序列互补，所述淬灭探针的3’端标记有荧光淬灭基团，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针，其特征在于，所述荧光发光基团包括FAM、VIC、TET；

所述荧光淬灭基团包括TAMRA、QSY、BHQ。

3.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球中含有如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针。

4.根据权利要求3所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述冻干微球还包括检测引物组，所述检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S～23S rRNA基因区间保守序列设计，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述双链检测探针中所述发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2～1.8。

6.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球，其特征在于，所述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM。

7.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，其包括：

将如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针、检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；

将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为23～26μL，速冻成球后，冷冻干燥；

其中，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述LAMP反应基液包括：BST聚合酶、dNTPs、MgSO₄、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH₂O和buffer。

9.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述扩增反应体系与所述冻干保护剂的体积比为14～16:8；

所述冻干保护剂包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一种。

10.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测方法，其特征在于，其包括：

将如权利要求3～6任一项所述的冻干微球加水复溶后，形成LAMP反应体系；

将来自待测样品中的模板DNA与所述LAMP反应体系混合，于60～65℃下反应50～70min，进行LAMP扩增。