[发明专利]一种刺激树突状细胞成熟的方法及培养基

说明书

本发明公开了一种刺激树突状细胞成熟的方法，在未成熟树突状细胞刺激成熟过程中加入无水乙醇进行刺激成熟培养。上述刺激树突状细胞成熟的方法，具体包括如下步骤：（1）将未成熟的树突状细胞铺于培养皿中，加入培养基培养，待其贴壁后，换液；（2）在步骤（1）得到的细胞中再加入含有无水乙醇的培养基刺激培养至少24小时，收集细胞及上清。本发明经实验证实可有效促进DC细胞成熟，而且刺激成熟的效果优于现有技术中的LPS和TNF‑α组，并且可以有效上调细胞表面抗原CD54、CD80、CD86及抗原呈递分子MHC II表达。

技术领域

本发明涉及一种树突状细胞刺激成熟的方法及刺激成熟用培养基，属于生物技术领域。

背景技术

树突状细胞 (dendritic cells,简写为DCs) 是目前发现的功能最强大的能激活初始型T淋巴细胞的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, 简写为APC)。DC2.4细胞是通过转染癌基因v-myc和v-raf的C57BL/6小鼠骨髓细胞而建立的永生化细胞系，具有很强的吞噬功能，是用于DC研究的一种标准的未成熟细胞系。通过化学试剂刺激，可以改变细胞表面抗原的表达，促进其成熟。

树突状细胞疫苗(dendritic cell vaccine,DC疫苗)是指负载了相关抗原的成熟DC，是近年发展起来的最有潜力的新型免疫治疗方法之一。DC疫苗对某些肿瘤的临床治疗已取得显著疗效，而由HBV表面抗原(HBsAg)负载的DC疫苗能在健康志愿者和慢性乙型肝炎（CHB）病人体内诱导出抗HBV特异性免疫反应。因此，发展HBV特异性DC疫苗在治疗CHB的临床应用中具有重要意义，建立DC疫苗制备的质量控制与评价体系，是HBV特异性DC疫苗临床试验的前提。

DC细胞体外刺激成熟的方法没有统一标准，目前现有技术主要采用TNF-α或LPS（脂多糖）来刺激DC成熟。LPS和TNF-α刺激DC的成熟度效果不佳。主要技术问题在于：它们可在一定程度上刺激DC成熟, 但仍无法得到与临床所需疗效相匹配的高度成熟DC。有研究表明，TNF-α催熟的DC细胞在功能上有缺陷，在细胞成熟后几乎不能分泌IL-12。DC诱导免疫激活的前提是需要足够数量的高度成熟DC,及表达足够量的抗原肽和分泌大量细胞因子, 才能有效地诱导免疫应答, 发挥临床疗效。LPS刺激DC成熟还有个难以克服的操作问题，即生产LPS厂家不同造成LPS纯度不同，所以刺激DC成熟使用的LPS浓度也不同，造成操作上的繁琐及结果的不确定。另外LPS保存条件比较严格，4℃仅能存放一个月，想要长期存放需-20℃存放，但应避免反复冻融，增加了操作的复杂性。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种刺激树突状细胞成熟的方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种刺激树突状细胞成熟的培养基。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种刺激树突状细胞成熟的方法，在未成熟树突状细胞刺激成熟过程中加入催熟剂无水乙醇进行刺激成熟培养，所述方法步骤如下：

（1）将未成熟的树突状细胞铺于培养皿中，加入培养基培养，待其贴壁后，换液；

（2）将步骤（1）得到的细胞在含有催熟剂无水乙醇的培养基中刺激培养中至少24小时，收集细胞及上清。

其中较优地，所述无水乙醇的添加浓度为400 mmol/L～800 mmol/L。

其中较优地，所述培养基为1640完全培养基。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种刺激树突状细胞成熟的方法，包括如下步骤：

（1） 获取树突状细胞前体单个核细胞PBMC，在第一培养基培养下获得未成熟树突状细胞；

（2） 将在步骤（1）得到的细胞在第二培养基中促成熟培养，培养时间至少24小时，得到树突状细胞；