[发明专利]一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用，所示检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：获取重组蛋白鲎C因子蛋白；将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。本发明具有操作简单，反应时间短，重复性好以及灵敏度高的优点，对检测设备没有特别的要求，而且携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要。

技术领域

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，具体而言，涉及一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用。

背景技术

内毒素是革兰氏阴性杆菌(gram-negativebacteria，GNB)细胞膜外壁的主要组成部分，对细菌的稳定性起重要作用。细菌内毒素分子是一种双糖结构的酰胺类脂复合物，其分子量一般在2000～2300之间，因分子量小，极易从肠系膜或组织液侵入，随血液进入循环系统。内毒素几乎无处不在，是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致病介质。内毒素血症是由于血液中或病灶内细菌释放出大量细菌内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起的一种病症。当机体受到创伤(包括手术)、烧伤、感染、放疗、化疗和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜通透性增高，肠黏膜对细菌和内毒素的通透性增高，细菌和内毒素就会大量进入血液。

目前常用的内毒素检测方法包括凝胶法、浊度法和显色法等方法。其中，凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点，可以进行定性或者半定量检测，该方法结果判读简便、经济、便捷，但精密度较差，凝胶形成容易受反应物中诸多因素影响，无法精确定量检测。浊度法是利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化，通过浊度仪测定内毒素含量的方法，该方法检测范围宽、操作简便，广泛地应用于临床，但是需要配套仪器试剂。显色法是利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少，通过分光光度计或者荧光光度计测定内毒素含量的方法，但该方法所需仪器和试剂都较昂贵，操作较复杂。以上几种检测方法测量范围达到0.005～300.000EU/mL，但是受个人临时操作以及实验环境影响很大，受到仪器的制约，每次结果差别较大，影响内毒素检测的精度。

近年来显色法得到了进一步的发展，基于重组C因子开发出来的荧光检测技术进一步提高了内毒素检测的速度以及灵敏度。但目前的内毒素的检测方法很难做到快捷，方便的现场检测，对于很多需要随时进行有效监测的应用造成很大困难。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种检测灵敏度高且能够快捷、方便的对内毒素进行检测的内毒素荧光微球探针。

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，包括如下步骤：

获取重组蛋白鲎C因子蛋白；

将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；

将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；

用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。

进一步地，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有His标签的载体pET-21a与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得PET-21a-rFC1质粒；

将PET-21a-rFC1质粒导入大肠杆菌中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

进一步地，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：