[发明专利]一种检测内毒素的荧光微球探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取重组蛋白鲎C因子蛋白；

将羧基化的荧光微球活化，获得活化后的荧光微球；

将所述活化后的荧光微球和所述重组蛋白鲎C因子蛋白进行偶联反应，获得偶联微球；

用氨基化PEG和乙醇胺封闭所述偶联微球上未反应的基团，获得检测内毒素的荧光微球探针。

2.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有His标签的载体pET-21a与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得PET-21a-rFC1质粒；

将PET-21a-rFC1质粒导入大肠杆菌中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白采用如下方法制备得到：

获取重组蛋白鲎C因子基因，将所述重组蛋白鲎C因子基因进行扩增；

将带有Fc标签的载体pINFUSE-hIgG1-Fc2与扩增后的重组蛋白鲎C因子基因依次进行双酶切和DNA酶连接后，获得pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒；

将pINFUSE-hIgG1-Fc2-rFC2质粒导入HEK293/CHO细胞中进行表达和纯化，获得重组蛋白鲎C因子蛋白。

4.根据权利要求1所述的检测内毒素的荧光微球探针的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白鲎C因子蛋白的加入量为所述活化后的荧光微球上的羧基摩尔量的1～10倍。

5.一种检测内毒素的荧光微球探针，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种内毒素检测试纸，其特征在于，包括权利要求5所述的检测内毒素的荧光微球探针。

7.根据权利要求6所述的内毒素检测试纸，其特征在于，还包括样品垫、荧光微球结合垫、硝化纤维素膜、吸水板和底板，硝化纤维素膜设置于所述底板的中部，所述硝化纤维素膜上设置有内毒素反应检测线和内毒素质控线，所述底板的一端端头设置有所述吸水板，在所述底板的另一端端头设置有所述样品垫，所述样品垫压设在所述荧光微球结合垫上，所述硝化纤维素膜的两端分别与所述吸水板和所述荧光微球结合垫交叠连接，所述检测内毒素的荧光微球探针固定在所述荧光微球结合垫上。

8.根据权利要求7所述的内毒素检测试纸，其特征在于，所述荧光微球结合垫包括玻璃纤维，所述玻璃纤维上喷涂有所述检测内毒素的荧光微球探针，所述玻璃纤维和所述检测内毒素的荧光微球探针采用相同的缓冲液浸泡。

9.根据权利要求7所述的内毒素检测试纸，其特征在于，所述内毒素反应检测线上固定有偶联复合物，所述偶联复合物由内毒素与大分子共价偶联形成上；所述内毒素质控线上固定有His标签抗体或Fc标签抗体。

10.一种内毒素的检测方法，其特征在于，采用权利要求6至9任一项所述的内毒素检测试纸进行检测，包括如下步骤：

将不同浓度的内毒素标准品滴加到样品垫上，经过层析后，测定内毒素反应检测线和内毒素质控线的荧光强度，根据内毒素反应检测线的荧光强度的变化，制作标准曲线；

将带有内毒素的待测样品用缓冲液稀释后，滴加到所述样品垫上，经过层析后，测定所述内毒素反应检测线和所述内毒素质控线的荧光强度，根据所述标准曲线计算出待测样品中内毒素的含量。