[发明专利]一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法，所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、用于CRISPRCas12a反应的crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白，用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:11和16所示，用于CRISPRCas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；该方法快速、可视，且特异性好，敏感度高，可作为一种临床检测阴道毛滴虫的工具，对设备要求较低，特别适用于大规模人群筛查，为公共卫生机构的监测提供良好的技术手段。

技术领域

本发明涉及医学检测领域，具体为一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法。

背景技术

阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，TV)是一种胞外寄生虫，属于单细胞鞭毛原生动物寄生虫，是一种微需氧寄生虫。通过对上皮细胞的粘附作用，从而寄生于宿主的阴道和尿道，TV的发病机制主要为：寄生虫对宿主细胞的杀灭、破坏阴道微生物稳态、通过激活宿主免疫反应引起炎症以及免疫逃避反应等。阴道毛滴虫侵入生殖系统或者泌尿系统后，不论对男性或是女性都会诱发感染，而造成较为严重的后果。该病可表现出生殖器症状，包括阴道红斑、瘙痒和气味，产生灰绿或黄绿色分泌物，排尿困难等。在女性感染中阴道毛滴虫除引起阴道炎外、宫颈炎、尿道炎、不育等，还与许多围产期并发症相关，引起胎膜早破、早产、低体重儿等；在男性感染中可引起阴道毛滴虫性疾病(包括非淋菌性尿道炎、前列腺炎等)，同时阴道毛滴虫感染增加人类免疫缺陷病毒(HIV) 的传播，并与宫颈癌和前列腺癌的发病率和严重程度有关。阴道毛滴虫是全世界最常见的非病毒性传播感染(STI)的病原体，每年将会引起大约2.7亿人感染，然而，没有表现出症状的感染比例估计在40％到80％之间，因此有效的诊断手段对阴道毛滴虫的防治尤为重要。

目前常用的阴道毛滴虫诊断方法有培养法、湿片镜检法等，近年来也陆续开发出酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、胶体金快速检测、直接荧光抗体试验(DFA)、胶乳凝集试验(LAT)等用于检测阴道毛滴虫的方法。临床上最常用的诊断方法是湿片镜检法，适用于有感染、分泌物、瘙痒或阴道异味症状的妇女，其操作简单、省时，但由于检测灵敏度跨度比较大，所以检测率浮动较大，不适用于经验不丰富的检验人员。培养法是目前临床诊断上公认的金标准，但其检测方法周期较长，费时费力，此外，培养法和湿片镜检法都需要显微镜人工检查，不能实现自动化批量检测，重复率较差。聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)是一种灵敏度高、特异性强、反应迅速的诊断技术。基于PCR技术已经建立了多种方法用于诊断阴道毛滴虫及基因型的鉴定，在PCR方法基础上，通过引入荧光标记的探针，可以实时检测靶标的扩增情况，称为Real time PCR，这种方法不仅是快速、灵敏，同时也可以进行定量分析，这些方法无论在灵敏度还是在特异性上，都具有其它方法不可比拟的优势，然而这种方法操作比较繁琐，不仅需要相关专业操作培训，还需采购体积较大、价格昂贵的设备，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。除了传统PCR，环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术也已被开发用于检测动物病原体。与传统 PCR相比，LAMP检测方法操作简单，但反应中的多对引物的加入使其可靠性降低，可能产生假阳性检测结果。RPA是一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37～42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～ 40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器，但具有容易出现假阳性等缺点。