[发明专利]一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，包括试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、用于CRISPR Cas12a反应的crRNA、荧光报告基团、侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧流层析试纸条，以及用于CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述Cas12a蛋白为pGEX-4T-1-Cac12a重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和16所示，用于CRISPR Cas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法，其特征在于：所述用于CRISPR Cas12a反应的crRNA的报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列；用于荧光检测时，荧光报告探针为5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于侧向流免疫层析检测时，试纸条报告探针为5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′。

5.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，RPA反应体系20μL：其中包括RPA上游扩增引物0.50μM，RPA下游扩增引物0.50μM，1×Rehydration Buffer，MgOAc 14mM，待检测样本基因组DNA2μL，其余用水补足至20μL；RPA扩增程序为：恒温37℃或39℃，反应30min。

6.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述用于CRISPR反应的缓冲液包括：Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测阴道毛滴虫时，CRISPR Cas12a检测体系50μL：包含100ng RPA扩增靶基因产物，crRNA250nM、RNase Inhibitor0.5μL、探针200nM、Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O补足至50μL；CRISPR程序为：使用EasyPGX定量PCR仪37℃反应40min，每隔2min采集一次FAM荧光，或在37℃水浴锅反应1h后加入无酶水补足至80uL后滴加于CRISPR Cas12a/Cas13a专用试纸条上肉眼观察结果。

8.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的方法，其特征在于：将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使增强的Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使用；同时可以根据现有条件选取荧光法(通过仪器或蓝光激发肉眼观察)或侧流层析试纸条法(直接裸眼观察)。