[发明专利]一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法

权利要求书

1.一种检测转基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配置标准品：

移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液于容量瓶中用纯水定容后得到混合标准储备液，然后利用纯水逐级稀释混合标准储备液，得到浓度逐级变化的混合标准溶液系列；

(2)样品提取、净化和衍生：

将待测的转基因大豆样品均质化处理得到均质，向大豆均质中加入同位素内标溶液，依次使用盐酸-水溶液和草甘膦检测基质方法包提取、二氯甲烷脱脂、超声提取和离心，取上清液过RM净化柱后得到净化液；取所得净化液加入四硼酸钠水溶液和FMOC-Cl乙腈溶液，摇匀，密封，衍生，过有机滤膜得到待测液，待上机检测；

(3)测定分析混合标准溶液系列：

将步骤(1)中得到的混合标准储备液进行色谱分离、质谱测定分析，得到草甘膦和氨甲基膦酸的保留时间、特征离子和离子碎片质量色谱图；将步骤(1)中的到的浓度逐级变化的系列混合标准溶液，按步骤(2)中的衍生法进行衍生后，采用UPLC-MS/MS以步骤(3)的仪器条件进行测定分析，以同位素1,2-C13N15草甘膦作为内标物进行定量，以定量离子与同位素内标峰面积比值为纵坐标(Y)，质量浓度与内标浓度比值为横坐标(X，ng/ml)绘制标准工作曲线；

(4)定性定量转基因大豆样品中草甘膦和氨甲基膦酸：

将步骤(2)中到的转基因大豆样品的待测液，按照步骤(3)中的条件进行色谱分离、质谱测定分析，得到转基因大豆样品的色谱图和峰面积，与步骤(3)中的质量色谱图进行匹配分析且带入标准曲线进行计算，通过内标法能够定性、定量分析测定出转基因大豆样品中的草甘膦和氨甲基膦酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液，质量浓度为1000mg/L，称取相同质量的草甘膦和氨甲基膦酸后用纯水溶解制备而成的；准确移取草甘膦和氨甲基膦酸混合标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用纯水定容至100ml，制备成10mg/L的混合标准储备液，于4℃下储存备用；所述的混合标准溶液系列，逐级变化的浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的均质化处理，操作步骤为：将大豆是置于粉碎机粉碎，过60目筛得到质化后的转基因大豆样品；精准称取2.00g均质化后的转基因大豆样品后加入50μL浓度为1μg/mL的同位素内标溶液；所述的同位素内标溶液为同位素1,2-C13N15草甘膦内标溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的盐酸-水溶液提取，操作步骤为：向体系中加入10ml盐酸-水溶液，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的盐酸-水溶液为0.1％盐酸溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的草甘膦检测基质方法包提取，操作步骤为：向体系中加入100mg草甘膦检测基质方法包，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm。所述的基质缓冲包为草甘膦检测基质方法包。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的二氯甲烷脱脂，操作步骤为：向体系中加入10ml二氯甲烷，涡旋混合1min、涡旋转速为2000rpm；所述的超声提取，超声提取的频率为40KHz，超声提取时间为15min；所述的离心，转速为10000r/min、离心时间为5min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的RM净化柱，在使用前需用6mL甲醇活化，6mL去离子水平衡；取5mL上清液过RM净化柱，收集后可得2.5mL净化液。