[发明专利]一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法

说明书

本发明公开了一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法，用TAE/Mgsupgt;2+/supgt;缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block；用TAE/Mgsupgt;2+/supgt;缓冲液将DNA‑H1、DNA‑H2、DNA‑H3、DNA‑H4退火形成发夹DNA‑H1，发夹DNA‑H2，发夹DNA‑H3，发夹DNA‑H4；用三(2‑羧乙基)膦)还原巯基修饰的DNA‑H1，然后滴至金电极表面孵育10小时，再用6‑巯基‑1‑己醇处理0.5‑1h；将双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与发夹DNA‑H2混合滴至金电极表面进行反应；再将发夹DNA‑H3、发夹DNA‑H4混合滴至电极表面进行反应；在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面，避光孵育，超纯水冲洗、Nsubgt;2/subgt;吹干，得到检测APE1酶的超灵敏电极；将上述超灵敏电极置于PBS中，进行方波伏安法信号检测，得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号，并绘制出标准曲线；把待测样品加入到超灵敏电极表面，37℃下孵育，设定一样的检测条件，测得不同待测样品的SWV信号，获得APE1酶的特异性检测结果。

技术领域

本发明属于生物化学分析方法，具体涉及一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法。

背景技术

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶又称氧化还原效应因子1(即APE1)是一种重要的DNA修复蛋白，在碱基切除修复(BER)过程中，它通过切割无碱基(AP)位点维持基因组稳定性。它还参与调节细胞对氧化应激条件的反应。在肿瘤细胞中发现了APE1的异常表达，癌细胞中APE1的水平通常会升高。迄今为止，已经开发出许多用于检测APE1的方法，例如酶联免疫吸附测定，电化学免疫测定，电化学发光免疫传感器和荧光DNA探针。随着对APE1酶的研究增多，在对追求APE1检测的灵敏度和选择性要求越来越高，因此对其研究的越来越广泛。DNA出色的可编程性使DNA walker的构建成为可能，DNA walker的渐进运动提供了执行多项任务和信号放大的可能性，为分子运输，生物传感器和生物合成提供了有价值的平台。因此，基于DNA walker的有效信号放大，结合灵敏的电化学信号方法，为APE1酶的检测可能提供了一种独特的思路。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法。具体提供了如下的技术方案：

1、一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法，步骤为：

1)用TAE/Mg²⁺缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block；

2)用TAE/Mg²⁺缓冲液将DNA-H1、DNA-H2、DNA-H3、DNA-H4退火形成发夹DNA-H1，发卡DNA-H2，发卡DNA-H3，发卡DNA-H4；

3)用三(2-羧乙基)膦)还原巯基修饰的DNA-H1，然后滴至金电极表面孵育10小时，再用6-巯基-1-己醇处理0.5-1h，以减少非特异性吸附；

4)将步骤1)得到的双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与步骤2)的发夹DNA-H2混合滴至金电极表面进行反应；

5)再将DNA-H3、DNA-H4混合滴至电极表面进行反应；

6)在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面，避光孵育，超纯水冲洗、N₂吹干，得到检测APE1酶的超灵敏电极；

7)将步骤6)得到的超灵敏电极置于PBS中，进行方波伏安法信号检测，得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号，并绘制出曲线；

8)把待测样品加入步骤6)得到超灵敏电极表面，37℃下孵育，设定与步骤6)一样的检测条件，测得不同待测样品的SWV信号，获得APE1酶的特异性检测结果。