[发明专利]一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法

权利要求书

1.一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤为：

1)用TAE/Mg²⁺缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block；

2)用TAE/Mg²⁺缓冲液将DNA-H1、DNA-H2、DNA-H3、DNA-H4退火形成发夹DNA-H1，发夹DNA-H2，发夹DNA-H3，发夹DNA-H4；

3)用三(2-羧乙基)膦)还原巯基修饰的发夹DNA-H1，然后滴至金电极表面孵育10小时，再用6-巯基-1-己醇处理0.5-1h；

4)将步骤1)得到的双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与步骤2)的发夹DNA-H2混合滴至金电极表面进行反应；

5)再将发夹DNA-H3、发夹DNA-H4混合滴至电极表面进行反应；

6)在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面，避光孵育，超纯水冲洗、N₂吹干，得到检测APE1酶的超灵敏电极；

7)将步骤6)得到的超灵敏电极置于PBS中，进行方波伏安法信号检测，得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号，并绘制出标准曲线；

8)把待测样品加入步骤6)得到超灵敏电极表面，37℃下孵育，设定与步骤7)一样的检测条件，测得不同待测样品的SWV信号，获得APE1酶的特异性检测结果；

所述的巯基修饰的DNA-H1序列为SEQ ID NO.1；所述的双足DNA walker序列为SEQIDNO.2；所述的封闭链block序列为SEQ ID NO.3；所述的DNA-H2的序列为SEQ ID NO.4；所述的DNA-H3的序列为SEQ ID NO.5；所述的DNA-H4序列为SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与发夹DNA-H2反应的时间为1h-3h，步骤5)所述的发夹DNA-H3与发夹DNA-H4反应的时间为1h-3h。

3.根据权利要求2所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与发夹DNA-H2反应的时间为2.5h，步骤5)的发夹DNA-H3与发夹DNA-H4反应的时间为2h。

4.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤1)所述的TAE/Mg²⁺缓冲液组成为40mM Tris，20mM醋酸，1mM EDTA，10mM Mg²⁺，pH＝8。

5.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，所述的双足DNA walker与封闭链block等摩尔量，所述的DNA-H2、DNA-H3和DNA-H4等摩尔量。

6.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤4)所述的APE1酶范围为0.001-1000U/mL。

7.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的6-巯基-1-己醇的用量为1-5mM。

8.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤7)所述的亚甲基蓝的用量为1-5mM。

9.根据权利要求1所述的一种检测APE1的DNA walker分析检测方法，其特征在于，步骤8)的方波伏安法的参数设置为Init E：-0.5V，Final E:0.1V，Quite Time:2s，其余参数使用默认设置。