[发明专利]一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，该方法包含：(1)花梗外植体的选取：以松散型花椰菜作为供体植株，选取横径在0.3～0.8cm的花梗作为外植体；(2)外植体的灭菌；(3)外植体的预培养；(4)外植体的浸染；(5)外植体与菌液共培养；(6)外植体延迟培养；(7)外植体筛选培养；(8)抗性芽的生根培养；(9)再生植株的阳性检测。本发明的方法首次建立了以花椰菜花梗为外植体的高效遗传转化，结合PCR检测和GUS染色结果，遗传转化植株阳性率达到了10～15％，在花梗芽再生过程中，不需要愈伤组织的诱导，可以直接再生出芽，大大缩短了芽再生所需时间。

技术领域

本发明涉及一种花椰菜高效遗传转化方法，具体涉及一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法。

背景技术

花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis，2n＝2x＝18)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一种重要的特色蔬菜，在世界范围内被广泛种植和食用。然而，花椰菜起源于地中海沿岸，收集和鉴定的花椰菜种质资源非常有限，导致国内自主选育的花椰菜品种在花球商品性、病虫害抗性及高温或严寒气候的耐受性等方面存在缺陷。因此，如何利用基因工程手段，快速、定向遗传改良现有种质成为育种研究领域最重要的课题之一。

农杆菌介导的遗传转化技术可以实现外源优异基因的快速转入和整合以及靶标内源基因的定点突变，为优异种质的定向创制提供了快速、高效的解决方案。另一方面，随着甘蓝、青花菜和花椰菜等甘蓝类蔬菜作物基因组测序工作的完成，海量的基因组数据需要可靠的遗传转化体系来进行目标基因的功能验证。因此，建立一种简单高效的花椰菜遗传转化方法，对花椰菜分子育种及基因功能研究具有重要意义，同时也对其它甘蓝类蔬菜的分子功能研究提供借鉴。

至今，包括花椰菜在内的甘蓝类蔬菜关于遗传转化的研究主要集中在芽再生体系的建立及遗传转化条件的优化，遗传转化成功的报道较少，并且都存在转化效率较低，试验可重复性较差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，解决了花椰菜遗传转化的问题，以花梗为外植体，不需要愈伤组织的诱导，可直接再生出芽，大大缩短了芽再生所需时间，而且遗传转化植株阳性率能够达到10～15％。

为了达到上述目的，本发明提供了一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，该方法包含：

(1)花梗外植体的选取：以松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后 10～20d，花球抽枝10～15cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在0.3～0.8cm的花梗作为外植体；对于外植体，若外植体横径小于0.3cm，外植体太嫩，对农杆菌的耐受能力弱，并且切口与浸染液的接触面积太小，显著降低遗传转化阳性率；而外植体横径大于0.8cm，切口面积太大，培养过程中会产生大量的醌类物质，使切口褐化加速，显著降低芽再生效率。因此，横径在0.3～0.8cm的花梗外植体，具有较高的芽再生能力，同时对农杆菌的耐受能力较强(而且农杆菌浸染20～30min时，外植体褐化程度很低)，最适合于农杆菌介导的遗传转化；

(2)外植体的灭菌：将所述花梗清洗并灭菌；

(3)外植体的预培养：将灭菌后的花梗吸干表面水分，并切除花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～0.8cm的小段，在外植体预培养基中将花梗形态学上端接触培养基，在23～25℃下预培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0 mg/L 6-BA、0.02mg/L NAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT，pH为5.6～6.0；