[发明专利]一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包含：

(1)花梗外植体的选取：以松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后10～20d，花球抽枝10～15cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在0.3～0.8cm的花梗作为外植体；

(2)外植体的灭菌：将所述花梗清洗并灭菌；

(3)外植体的预培养：将灭菌后的花梗吸干表面水分，并切除花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～0.8cm的小段，在外植体预培养基中将花梗形态学上端接触培养基，在23～25℃下预培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基为：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA、0.02mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans-ZT，pH为5.6～6.0；

(4)外植体的浸染：将预培养的外植体置于外植体浸染液中进行浸染；其中，所述外植体浸染液的配制，包含：将构建有目的基因载体pCambia1301的农杆菌菌株GV3101，于28℃震荡培养过夜至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8，菌液离心，弃上清，用相同体积的无菌MS-蔗糖溶液悬浮，添加终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮，获得外植体浸染液；其中，所述无菌MS-蔗糖溶液包含：MS液体培养基和20g/L蔗糖；所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(5)外植体与菌液共培养：将经过浸染的外植体表面的液体吸干，在外植体共培养基的表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体竖直放置在滤纸上，使花梗形态学上端接触培养基，在黑暗条件下共培养3d；其中，所述外植体共培养基为：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA、0.02mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans-ZT，pH为5.6～6.0；

(6)外植体延迟培养：将经过共培养的外植体，转移至外植体延迟培养基中，花梗形态学上端接触培养基，在23～25℃延迟培养8d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体延迟培养基为：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA、0.02mg/LNAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT、300mg/L特美汀，pH为5.6～6.0；

(7)外植体筛选培养：将经过延迟培养的外植体转移至外植体筛选培养基中，花梗形态学下端接触培养基，在23～25℃筛选培养，光照时间为16h/d，筛选培养13～15d，直至长出抗性芽；其中，所述外植体筛选培养基为：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA、0.02mg/LNAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT、300mg/L特美汀、5mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；

(8)抗性芽的生根培养：将再生的抗性芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养5～7d长出须根；其中，所述芽生根培养基为：MS培养基、0.05～0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、300mg/L特美汀、5mg/L潮霉素，pH为5.8～6.0；

(9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为花椰菜遗传转化阳性苗；其中，所述PCR，以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，采用的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，PCR产物的条带在568bp处，则结果为阳性；所述GUS染色，叶片白色背景上有蓝色小点为阳性。

2.根据权利要求1所述的以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述花梗灭菌采用的灭菌液包含：70％乙醇和4％次氯酸钠。

3.根据权利要求2所述的以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述花梗灭菌：将花梗剪短为3～4cm用灭菌液灭菌，然后用无菌水清洗。

4.根据权利要求1所述的以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述外植体的浸染时间为20～30min，摇床摇晃速度为50～60rpm。