[发明专利]一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明属于外泌体技术领域，公开了一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用，其中所述的制备方法包括：S1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；S2.制备卵泡液外泌体；S3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体：按比例均匀混合步骤S1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤S2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于‑80℃冰箱中冻存；综上，本发明首次有效实现了子宫内膜间充质干细胞外泌体与卵泡液外泌体的联合应用；并且，基于本发明制备方法制备得到的复合外泌体具有纯度高、安全高效的优点，对于子宫内膜损伤修复还具有显著的靶向治疗效果。

技术领域

本发明属于外泌体技术领域，具体涉及一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用。

背景技术

人流、刮宫等妇科手术给女性子宫内膜损伤带来了巨大的伤害，导致越来越多的女性不孕不育，妇科疾病频发。干细胞在组织修复与再生医疗方面扮演者重要的角色，已被应用于原发/继发性卵巢早衰和薄型/粘连型子宫内膜的改善治疗中。研究表明，干细胞所发挥的组织修复与再生功能主要是由其旁分泌作用而实现的，而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子，并且外泌体移植规避了干细胞致瘤的缺点，但如何快速制备高活性外泌体并应用于妇科疾病的治疗相关报道甚少。

子宫内膜间充质干细胞是子宫内膜再生和修复的种子细胞，能够一定程度上治疗和修复子宫内膜损伤。子宫内膜间充质干细胞通过释放大量的外泌体来构建一个稳态的组织修复的微环境，从而消除炎症反应，促进细胞再生，伤口愈合，修复组织病变。然而，单一细胞来源的外泌体修复作用仍难以满足实际需求。

超排卵泡液由血浆渗出物和卵巢局部分泌物组成，由于卵巢血管未穿过卵泡基膜，卵泡液直接提供了颗粒细胞和卵子的生存环境，卵泡液微环境中富含调节卵子发育的激素和相关细胞因子，更有研究已证实，卵泡液外泌体富含RNA、miRNAs和蛋白，作为通讯媒介，在促进卵泡生长发育(颗粒细胞增殖)、成熟、排卵、闭锁过程中发挥重要的调控作用。人体卵巢和子宫均为受促性腺激素、雌孕激素周期性调节的生殖器官，来自于子宫内膜间充质干细胞和卵泡液的外泌体理论上均可以作为通讯媒介，改善损伤组织的微环境，促进细胞增殖，使损伤子宫内膜获得修复。

综上，在现有技术中，例如专利CN108815189A已有对子宫内膜间充质干细胞外泌体制备技术的公开，但是还没有能够联合子宫内膜间充质干细胞外泌体与卵泡液外泌体、并将其应用到妇科疾病治疗、组织病变修复中的报道。

发明内容

鉴于此，为解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，包括：

S1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；

1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；将间充质干细胞放入T75细胞培养瓶中，在37℃、5％CO²的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；

1b)收取细胞培养上清液，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡，离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4mL、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用DPBS稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用PBS缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；

S2.制备卵泡液外泌体；

2a)收集该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；