[发明专利]一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，包括：

S1.制备自体子宫内膜间充质干细胞外泌体；

1a)自体子宫内膜间充质干细胞获取：从子宫内膜微刺激术获得的子宫内膜组织中分离出子宫内膜间充质干细胞；将间充质干细胞放入T75细胞培养瓶中，在37℃、5％CO²的条件下进行培养；待细胞生长程度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，直至细胞生长程度达到90％-95％；

1b)收取细胞培养上清液，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡，离心后取上清液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4mL、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用DPBS稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用PBS缓冲液重悬底部沉淀，获得子宫内膜间充质干细胞外泌体；

S2.制备卵泡液外泌体；

2a)收集该子宫内膜损伤的患者自体超排卵后的卵泡液，以1500g，室温离心15min，留上清液；

2b)将上清液2000g，4℃条件下离心30min，留上清液；

2c)上清液过30KD滤膜过滤，10000g，4℃条件下离心30min，取上面截留液依次以0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤；

2d)回收滤液置于超速离心管中，且在超速离心管底部铺有3-4mL、30％的重水蔗糖垫，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除蔗糖垫上面的上清液；用DPBS稀释蔗糖垫层后装入新的超速离心管中，120000g、4℃条件下超速离心70min后去除上清液，用DPBS缓冲液重悬底部沉淀，使其終体积为浓缩后体积的1/4，获得卵泡液外泌体；

S3.制备干细胞与卵泡液复合外泌体；

按比例均匀混合步骤S1制备的子宫内膜间充质干细胞外泌体与步骤S2制备的卵泡液外泌体，混合后无菌分装并置于-80℃冰箱中冻存。

2.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，还包括：

S4.宫腔灌注使用；

取3-5mL步骤S3所制备得到的复合外泌体，用DPBS稀释后置于无菌宫腔灌注移植注射器内，灌注设备尽可能将复合外泌体灌注至病灶位置。

3.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述T75细胞培养瓶中的培养基为：用无酚红DMEM/F12和体积比浓度为10％代血清做完全培养基。

4.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述复方电解质注射液采用复方电解质葡萄糖MG3注射液。

5.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，依次离心去除细胞、细胞碎片以及大膜泡的步骤包括：

离心去除细胞时，以300g、4℃的条件离心10min，离心后取上清液；

离心去除细胞碎片时，以2000g、4℃的条件离心15min，离心后取上清液；

离心去除大膜泡时，以10000g、4℃的条件离心30min，离心后取上清液。

6.根据权利要求1所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1以及步骤S2中，对所制备得到的外泌体均执行蛋白浓度测定和质量安全实验。

7.根据权利要求6所述的一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法，其特征在于：

控制所述步骤S1制备得到的子宫内膜间充质干细胞外泌体中蛋白浓度为0.4-0.7mg/mL；

控制所述步骤S2制备得到的卵泡液外泌体中蛋白浓度为1mg/mL。