[发明专利]一种耳软骨细胞及制备方法、再生耳软骨组织与应用

说明书

本发明公开了一种耳软骨细胞及制备方法、再生耳软骨组织与应用，耳软骨细胞制备方法包括如下步骤:步骤1:分别取耳尖、耳中央和耳根处的软骨组织，并分别剪碎；步骤2：将步骤1所得的耳尖软骨碎末置于浓度为2‑3g/L的I I型胶原酶液中进行消化，将耳中央软骨碎末置于浓度为4‑6g/L的I I型胶原酶液中进行消化，将耳根软骨碎末置于浓度为6‑8g/L的I I型胶原酶液中进行消化，消化液中固液质量体积比均为0.08‑0.12g/mL，分别得到耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液；步骤3：将步骤2所得的耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液混合后经40μm的细胞滤器过滤组织残渣，将滤液离心，去上清，重悬细胞，如此可显著的提高耳中央和耳根软骨细胞产量。

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种耳软骨细胞及制备方法、再生耳软骨组织与应用。

背景技术

耳软骨细胞是组织工程耳再造中重要的种子细胞，种植在合成材料构建的支架上，分泌软骨细胞外基质，最终形成成熟的软骨组织，可用于小耳畸形耳再造，耳软骨创伤缺损修复等，减少了自体软骨组织移植所造成的医源性损伤。同时耳软骨细胞也可作为工具细胞用于小耳畸形等发病机制的研究。但软骨组织细胞含量仅为5％-10％，是少细胞组织，主要由胶原、糖胺多糖、弹性纤维等细胞外基质构成。提取耳软骨细胞过程中，在降解细胞外基质的同时也会使细胞长时间暴露在消化酶中，不仅减少提取细胞数量，同时也降低了细胞活力。此外，我们发现耳软骨组织不同部位细胞外基质成分含量，细胞外基质作用力差异较大，若采用传统的统一胶原酶浓度进行消化，会降低耳根、耳中央等部位的提取效率，造成组织的浪费，而延长消化时间会对细胞活力造成很大影响，降低细胞产量和活力。

耳软骨细胞传统制备方法是：采用浓度为2-3g/L的II型胶原酶溶液消化软骨组织，消化条件为37℃摇床10h，每克软骨组织最终获取细胞数量为1.5*10⁶个。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种可对不同部位耳软骨组织进行梯度消化的耳软骨细胞制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种耳软骨细胞制备方法,包括如下步骤:

步骤1:分别取耳尖、耳中央和耳根处的软骨组织，并分别剪碎得到耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末；

步骤2：将步骤1所得的耳尖软骨碎末置于浓度为2-3g/L(可以是2g/L、2.5g/L或3g/L，优选的为2g/L)的II型胶原酶液中进行消化，将耳中央软骨碎末置于浓度为4-6g/L(可以是4g/L、5g/L或6g/L，优选的为6g/L)的II型胶原酶液中进行消化，将耳根软骨碎末置于浓度为6-8g/L(可以是6g/L、7g/L或8g/L，优选的为8g/L)的II型胶原酶液中进行消化，其中，消化液中固液质量体积比均为0.08-0.12g/mL(可以是0.8g/mL或0.12g/mL)，消化条件均为在36.3-37.2℃(可以是36.3℃、36.8℃或37.2℃，优选的为37℃)条件下摇床孵育8-12h，分别得到耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液；

步骤3：将步骤2所得的耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液混合后经40μm的细胞滤器过滤组织残渣，将滤液离心，去上清，重悬细胞，以1*10⁵-10*10⁵/cm²的密度种植于细胞培养皿中。

上述技术方案中所述耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末的质量比为1:4:4。

上述技术方案中所述步骤1中软骨组织为剥离皮肤及软骨膜的软骨。

上述技术方案中所述步骤2中消化条件为在37℃条件下摇床孵育10h。

上述技术方案中所述步骤3中离心条件为转速1000rpm/min的条件下离心5min。