[发明专利]微血管体外培养方法及培养液

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及微血管体外培养方法及培养液。本发明的微血管体外培养方法，具体包括分离、过滤和培养步骤，采用短时循环消化的方法从组织中分离微血管，减少了原代微血管细胞在酶溶液中的处理时间，降低了酶溶液对细胞的伤害，提高细胞活力。本发明还提供了一种微血管体外培养液，使得微血管可以在体外普通培养皿的硬基底表面以管状形式生长，同时保留同一组织来源的周细胞围绕在内皮细胞周围一起生长，更好地模拟体内微血管，并且可以在体外长时间培养。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物医学基础研究、药理研究、药物筛选和评价以及再生医学研究及临床应用领域，具体涉及微血管体外培养方法及培养液。

背景技术

微血管又称毛细血管，是分布于各种组织和器官中连通小动脉和小静脉之间的细小血管，其分支众多连通成网络，也被称为终末血管床。微血管在发育和组织再生过程中发挥着重要作用，很多疾病的发生伴随着微血管结构和功能的失调。微血管内皮细胞周围有周细胞包围，其嵌入内皮细胞基膜中，在促进微血管发育、稳定微血管结构、调控微血管功能等方面发挥重要作用。

动物模型是研究微血管疾病的重要工具，但是，由于动物和人在基因、生理和病理等方面的差异，在动物模型研究中得出的科学结论或药物实验结果，在人体中不一定可行。因此，人的微血管模型具有重要的研究意义和市场价值。

现有的微血管培养模型主要使用商用培养液，如EGM2MV，所使用的细胞包括多个组织来源的不同细胞类型，例如，来自人脐带静脉血管的内皮细胞、血液来源的血管内皮细胞、动脉血管内壁的血管内皮细胞、肾脏来源的内皮细胞、大脑来源的周细胞、诱导多能干细胞定向分化产生的血管内皮细胞、周细胞等等，这些方法各有其缺点，比如：

1、血管细胞具有异质性，不同器官的血管细胞具有各自特定的生物学特征，来自脐带静脉、动脉血管等大血管的内皮细胞难以代替微血管的内皮细胞，由诱导多能干细胞分化生成的血管细胞难以反映某一特定组织或器官的微血管生物学特征。

2、微血管内皮细胞和周细胞的共培养模型是研究二者相互作用，以及微血管稳定性的重要工具。在现有的微血管内皮细胞和周细胞共培养模型中，内皮细胞和周细胞分别来自不同的器官，例如将来自脐带静脉血管的内皮细胞和来自大脑的周细胞共培养，由于血管细胞的异质性，不同器官来源的内皮细胞和周细胞的共培养模型难以准确反映微血管的组织特异性。

3、现有的常用方法中，血管内皮细胞在普通培养皿的二维表面上以单层细胞片的形式生长，丢失了体内原有的管状形态。

4、现有的常用方法中，血管内皮细胞只有在水凝胶(如Matrigel、fibrin或胶原)表面或内部才能形成管状结构，但是很难在体外长期培养。在水凝胶表面形成的微血管仅能维持几天时间，水凝胶内部所形成的管状微血管结构一般最多培养两周时间。体外培养时间是限制体外微血管模型的一个重要因素。

5、利用水凝胶形成微血管的方法成本较高，三维微血管模型难以利用常规的免疫染色方法进行表征和检测，难以进行高通量筛选实验。

发明内容

根据现有技术上存在的缺陷，结合目前的研究前沿，本发明提供了微血管体外培养方法及培养液。

本发明是采用以下的技术方案实现的：

本发明提供了一种微血管体外培养方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)、分离：将组织块剪碎，置于胶原酶溶液中消化，分离胶原酶溶液中的细胞悬液离心，将获得的细胞沉淀重悬于PBS溶液中；将剩余组织块再次加入胶原酶溶液继续消化，收集细胞悬液并离心，离心后重悬；重复以上步骤，直至组织块消化完为止，离心收集所有细胞沉淀，重悬于PBS溶液中；

步骤(2)、过滤：将步骤(1)分离得到的细胞悬液，用细胞筛网进行过滤，红细胞和单细胞以及死细胞会通过筛网，而微血管段留在筛网上，用PBS溶液反向冲洗，收集微血管段；