[发明专利]微血管体外培养方法及培养液

权利要求书

1.一种微血管体外培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤(1)、分离：将组织块剪碎，置于胶原酶溶液中消化，分离胶原酶溶液中的细胞悬液离心，将获得的细胞沉淀重悬于PBS溶液中；将剩余组织块再次加入胶原酶溶液继续消化，收集细胞悬液并离心，离心后重悬；重复以上步骤，直至组织块消化完为止，离心收集所有细胞沉淀，重悬于PBS溶液中；

步骤(2)、过滤：将步骤(1)分离得到的细胞悬液，用细胞筛网进行过滤，红细胞和单细胞以及死细胞会通过筛网，而微血管段留在筛网上，用PBS溶液反向冲洗，收集微血管段；

步骤(3)、培养：将步骤(2)获得的微血管段，置于微血管培养液进行培养。

2.根据权利要求1所述的微血管体外培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述微血管培养液包括如下成分：DMEM/F12培养液、1-20％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1-20mM nicotinamide、1-10mM N-Acetyl-L-cysteine(NAC)、10-100μM Vitamin C、1-10μM glutathione、1-20μg/ml insulin、1-20μg/ml transferrin、10-100nM SodiumSelenite、5-50ng/ml血管内皮生长因子VEGF、0.01-20μM Wnt/β-catenin信号通路激活剂、0.01-20μM TGFβ/Smad信号通路抑制剂、0.1-20μM ROCK抑制剂。

3.根据权利要求2所述的微血管体外培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述微血管培养液包括如下成分：DMEM/F12培养液、1-5％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1-10mM nicotinamide、1-5mM NAC、10-50μM Vitamin C、1-5μM glutathione、5-15μg/ml insulin、1-10μg/ml transferrin、10-50nM Sodium Selenite、5-15ng/ml血管内皮生长因子VEGF、0.01-20μM Wnt/β-catenin信号通路激活剂、0.01-20μM TGFβ/Smad信号通路抑制剂、0.1-20μM ROCK抑制剂。

4.根据权利要求2或3任一项所述的微血管体外培养方法，其特征在于，所述Wnt/β-catenin信号通路激活剂包括Chir99021、R-Spondin-1、Wnt-1蛋白、Wnt-3a蛋白、Wnt-7a蛋白、Wnt-9b蛋白、Laduviglusib trihydrochloride、CHIR-99021HCl、SB415286、AZD1080、AR-A014418、LY2090314、BIO-acetoxime、9-ing-41、BRD0705、KY19382、SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、6-bromoindirubin-3-oxime、AZD2858、TDZD-8、Indirubin-3'-oxime、CP21R7、1-Azakenpaullone、IM-12、5-Bromoindole、Wnt agonist 1、MethylVanillate、WAY-316606、Foxy-5、SKL2001、IQ-1。

5.根据权利要求2或3所述的微血管体外培养方法，其特征在于，所述TGFβ/Smad信号通路抑制剂包括A83-01、SB431542、SD-208、GW788388、TP0427736HCl、RepSox、LY2109761、Ophiopogonin D、SB505124、SIS3、SIS3 HCl、BIBF-0775、LY3200882、Galunisertib、A77-01、Vactosertib、Halofuginone、BMS-986260、LY364947、Oxymatrine、Pirfenidone、Hypaconitine、SB525334、ITD-1、TP-008、SM16、R-268712、SD-208、GW788388、BIO-013077-01。