[发明专利]一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用，属于分析化学和食品安全领域。该拉曼传感器包括单链DNA‑普鲁士蓝纳米颗粒探针、由CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、缓冲液以及提取扩增后的羊乳样品DNA构成的Cas12a酶切反应体系、含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基底的金核银壳纳米颗粒溶液。将该拉曼传感器应用于羊乳中掺假成分为牛乳的检测中，目标DNA含量可以经拉曼光谱仪检测转化为超灵敏、抗干扰的拉曼信号。该拉曼传感器及其方法对目标DNA的检出限可达到aM级别，目标DNA的设计选取灵活，以牛线粒体cytb基因为目标DNA，能够应用于羊乳中的掺假成分为牛乳的检测中，具有快速、灵敏、准确以及背景干扰低等优点。

技术领域

本发明属于分析化学和食品安全技术领域，具体涉及一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用。

背景技术

乳品因其所含的丰富的营养物质，在各个年龄段的消费人群中都备受欢迎，在食品中占据重要地位。随着人们生活水平的提高，对营养更全面、更易吸收的高值乳品的需求量也在不断提升，在经济利益的驱使下，某些供应商在乳品中掺入便宜且不易分辨的原料。最常见的形式就是在高值羊乳中掺入牛乳。乳品掺假行为不仅损害了消费者经济利益、危害市场生产秩序，掺入的成分也存在诸如过敏等安全隐患。乳品真实性鉴别对保证食品质量安全具有重要意义。目前在乳品真实性鉴别主要有分析蛋白质、代谢物和核酸等方法。其中，基于蛋白质检测方法(如HPLC-MS)存在包括待测物的热稳定性差、仪器价格高、操作过程繁杂等不足；而基于代谢物的检测方法(如电子舌、红外)存在重复性低、准确性和灵敏度较差等不足。基于核酸的检测技术因核酸在加工过程中的稳定性、高特异性等优势已经广泛应用于乳品掺假的验证和证明，随着研究的深入与技术的更迭，检测技术与方法也在不断发展进步，但是行业仍急切需求高效灵敏且可实现现场检测的乳品真实性检测方法。

令人瞩目的是，在拉曼检测的基础上发展起来的表面增强拉曼散射技术近年来以特异性高、灵敏准确、设备小巧、操作方便等优点而备受好评，其已应用于医疗、环境监测、食品安全等各个领域。此外，表面增强拉曼散射技术已被应用于食品真实性分析，主要用其分析某类产品中的特殊小分子物质(如食用油中的脂肪酸、蜂蜜中的果糖)。而DNA因其官能团众多、结构复杂，强烈的生物背景干扰成为限制该技术在食品真实性分析中最大程度开发利用的主要原因。

普鲁士蓝纳米颗粒具有形状规则、易修饰、合成步骤简单等优点，而且具有良好的靶响应功能：在碱性条件下，普鲁士蓝纳米颗粒会与氢氧根反应，释放出大量的Fe(CN)₆^4-离子。其所含的特殊的C≡N结构可呈现出位于“拉曼生物沉默区”(1800cm^-1～2800cm^-1)区间的独特的拉曼峰特征。当碱处理后的溶液与SERS基底贵金属纳米颗粒混合并接受特定波长的拉曼光扫描后，高强度、高特异性、低生物背景干扰的拉曼峰就可以轻易获得。

生物传感器因其出色的生物相容性，识别特异性以及设计灵活性等优势，在疾病诊疗、食品安全以及环境监测等各个领域的应用中备受关注与青睐。表面增强拉曼检测技术更是因其可达单分子检测的准确程度，以及其操作简单、仪器便携等优点在食品安全，环境监测等领域均有应用。拉曼生物传感器巧妙地搭建起一个信号转化平台，通过生物自身的特异识别结合性质，将目标核酸浓度等生物信号转化为拉曼光谱信号。