[发明专利]一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，包括单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针、Cas12a酶切反应体系、含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基底的金核银壳纳米颗粒溶液；

其中，所述单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针中，单链DNA的5’端修饰生物素，3’端修饰氨基，单链DNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述Cas12a酶切反应体系由CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、缓冲液以及提取扩增后的羊乳样品DNA构成，其中，crRNA的识别序列与牛线粒体基因cytb上的片段互补，牛线粒体基因cytb上的片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。

2.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。

3.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所述扩增为环介导等温扩增，环介导等温扩增所用引物包括牛-FIP引物、牛-BIP引物、牛-F3引物和牛-B3引物；

其中，所述牛-FIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，牛-BIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，牛-F3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，牛-B3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

4.如权利要求3所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所用引物还包括牛-LF引物和牛-LB引物；

其中，所述牛-LF引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，牛-LB引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。

5.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，缓冲液为10×NEBuffer 2.1。

6.权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

1)以普鲁士蓝纳米颗粒和单链DNA为原料制备单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针并固定；

2)将Cas12a酶切反应体系加入至步骤1)中进行剪切反应，弃上清液，洗涤，加NaOH溶液处理，制得碱处理溶液；

3)将步骤2)制得的碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合，搅拌，滴在玻片上，拉曼光谱仪扫描，以空白组和实验组在拉曼位移为2083cm^-1处的峰值差为信号建立标准曲线，根据标准曲线测定含未知浓度牛乳的羊乳样品中目标DNA含量。

7.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤2)中，所述剪切反应的条件为在37℃条件下孵育30～80分钟。

8.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤3)中，所述碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液的体积比为1：10。

9.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤3)中，拉曼光谱仪扫描条件为：激光波长785nm，激光能量10mW，扫描时间为20秒，积分次数1次。

10.权利要求1-5任意一项所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器在检测羊乳的掺假成分为牛乳中的应用。