[发明专利]循环游离DNA中肿瘤相关突变基因检测的参考品

说明书

本发明提供一种肿瘤相关突变基因检测技术的参考品，具体为一种用于血浆游离DNA突变检测的参考品。本发明还提供含有所述参考品的参考品盘，包含所述参考品或参考品盘的试剂盒，以及它们的用途。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及检测中使用的参考品。本发明提供了一种用于血浆游离DNA中肿瘤相关突变基因检测的参考品，特别是作为循环的游离DNA(cfDNA)的阳性突变参考品。还提供包含该参考品的参考品盘，试剂盒以及制备所述参考品的方法。

背景技术

目前，获取肿瘤基因相关信息的主要来源仍是受试者的肿瘤组织样本。然而，对于部分晚期癌症患者而言，无法得到肿瘤组织样本，也不适合进行动态监测。

大量的临床研究证明，在外周血中存在循环的游离DNA(circulating free DNA，或cfDNA)，而在肿瘤患者的外周血cfDNA中包含循环肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumorDNA)。对血浆(或血清)中的游离DNA如cfDNA或ctDNA进行检测，可以避免有创性的组织活检，也方便重复采集样本。

利用血浆样本中cfDNA或ctDNA，可以获得关于肿瘤相关的基因的突变信息。这些信息有助于预测肿瘤患者的疾病发展，帮助选择靶向用药以及帮助预测治疗预后。因此，部分癌症的血浆样本ctDNA基因检测已被临床共识所推荐。

由于肿瘤ctDNA在样品中的含量较少，因此体外检测肿瘤ctDNA对检测技术的要求很高。近年来，仅有微滴式数字PCR(ddPCR)、高通量测序(NGS)等方法被广泛地用于检测ctDNA的突变情况。

参考品是基于基因检测的体外诊断过程中的重要组成部分。参考品在治疗药物、诊断试剂研发的整个过程中都扮演着重要的角色。在药物、试剂的研发过程中，在原材料、半成品和成品等的质量检验、试剂性能的确认等中均需要合适的参考品。

在ctDNA突变的检测中，对参考品种类、稳定性和检测下限等参数的要求更为苛刻。参考品的设置合理性、参考品的性能对试剂质量控制起到关键的作用。

并且，在整个试剂盒产品研发过程中需要使用参考品的环节众多，因此参考品也密切影响研发成本。

同时，通过设计参考品的配置使检测的反应数降低，能够大大降低临床进行检测的成本，从而减轻患者和社会的医疗负担。

目前，许多公司推出了肿瘤突变cfDNA检测试剂盒。在这些试剂盒中，组成参考品的DNA大部分是通过机械打断或酶切等方式获得。通过将这些DNA根据目标突变的分布进行组合，并与野生型DNA混合，最终形成了参考品。在这样的参考品中，以一定的突变频率包含了目标突变。例如，CN110578002A(广州燃石医学检验所有限公司)中公开了多种用于检测循环肿瘤DNA突变的质控品。

然而，现在市场上各公司的试剂盒中所用到的参考品无法同时满足上述需求。这些参考品在使用时的数量较多，涵盖的基因类型和突变位点较少。

因此，期望以数量较少的参考品实现更多种基因和/或多个突变位点的同时覆盖。

发明内容

本发明人创新性地开发出了一种优化的人肿瘤突变检测参考品盘。通过优化参考品组合方式和制备过程，提高了性能，显著降低了成本。

本发明的参考品盘适用于血浆中的游离DNA(包含cfDNA和ctDNA)的样本。本发明的参考品盘中包含阳性参考品，具体而言包含9种可独立使用的阳性参考品，每种阳性参考品各包含一组突变。所述9种阳性参考品共覆盖了33个热点肿瘤相关基因突变位点，能够满足市场上多个基因、多个突变的检测需求，质控性能优越。

第一方面，本发明提供用于血浆游离DNA突变检测的参考品，其中，所述参考品中包含野生型DNA片段和一种或多种突变型DNA片段，每种所述突变型DNA片段具有一种或多种碱基突变并且编码的氨基酸序列具有表1中列出的氨基酸突变。