[发明专利]一类P450酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一类催化维生素D₃合成25‑羟基维生素D₃的P450酶突变体，是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示P450酶的第75位氨基酸由亮氨酸分别突变为丙氨酸或甘氨酸或苏氨酸或组氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2‑NO.5所示。本发明还公开了所述P450酶突变体的制备方法及其在生产25‑羟基维生素D₃中的应用。实验证实所述P450酶突变体催化维生素D₃合成25‑羟基维生素D₃的效率最高可达P450BM3F87A的3.1倍。并且，整个生产25‑羟基维生素D₃的操作过程简单，工艺成熟，环境友好，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程、生物催化及生物化学与分子生物学技术领域，涉及一类催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的P450酶突变体及其应用。

背景技术

维生素D₃(vitamin D₃，胆钙化醇)为固醇类衍生物，是人和哺乳动物的生长发育、钙磷代谢、免疫、细胞增殖和分化等生命活动中起重要调控作用的一种脂溶性维生素。在人体中，维生素D₃是由皮肤中的7-脱氢胆固醇在暴露于紫外线的条件下转化而成。维生素D₃本不具有生物活性，在人体内需要经细胞色素P450酶的氧化作用转化为生理活性形式25-羟基维生素D₃(骨化二醇)和1α,25-二羟基维生素D₃(骨化三醇)，进而发挥调控上述重要生命活动的作用。由于25-羟基维生素D₃可促进机体对钙磷的吸收、调节免疫，故其也是临床上广泛应用于治疗佝偻病、骨质疏松和甲状腺功能衰退等疾病的重要药物。同时，它也被广泛地应用于食品保健、畜牧养殖业等领域，具有很高的经济价值。

工业上生产25-羟基维生素D₃主要采取化学合成策略，由于合成路线中需要复杂的基团保护和脱保护、光照、开环、异构化等多步反应而导致收率低于1％，成本高且不环保。相比之下，生物转化法的反应步骤简洁且反应条件温和，产物构型专一，是极具应用前景的技术手段。其中，从自然环境中筛选获得的微生物菌株已成功应用于从维生素D₃到活性形式25-羟基维生素D₃的生产。但由于野生型微生物菌株往往存在遗传背景未知、改造困难、细胞通透性差、不耐有机溶剂等限制。由于细胞色素P450酶可在温和条件下催化底物惰性碳氢键的选择性氧化，具备化学催化剂难以比拟的优势，是目前工业上催化氧化反应的生物催化剂的重要来源。目前，已发现的催化维生素D₃实现25位羟基化反应的P450催化系统主要为真核P450酶和单独的还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)组成的双组份系统，以及细菌P450酶和一对氧化还原伴侣蛋白组成的三组分系统，但两种系统均存在电子传递效率低、蛋白表达量低、组分复杂等制约因素。

申请人研究发现，如果以表达量高、晶体结构已知、催化效率高的单组分P450单加氧酶作为亲本酶，采用定向进化技术筛选出催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的高效突变体，有望实现提高转化效率以及降低25-羟基维生素D₃生产成本。来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的P450 BM3中，其P450结构域与它的CPR结构域天然融合，为催化自主型P450酶。P450 BM3的晶体结构已知且催化效率高，其催化天然底物羟基化反应的kcat值高达17000min^-1。然而，经文献和专利检索发现，目前国内外尚无采用P450 BM3野生型或突变体来催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一类催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的P450酶突变体及其应用。