[发明专利]一类P450酶突变体及其应用

权利要求书

1.一类催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的P450酶突变体，其特征在于：所述P450酶突变体分别命名为P450 BM3 F87A/L75A、P450 BM3 F87A/L75G、P450 BM3 F87A/L75T、P450BM3 F87A/L75H；其中所述P450 BM3 F87A/L75A是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的P450酶的第75位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述P450 BM3 F87A/L75G是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的P450酶的第75位氨基酸由亮氨酸突变为甘氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述P450 BM3F87A/L75T是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的P450酶的第75位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述P450 BM3 F87A/L75H是由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的P450酶的第75位氨基酸由亮氨酸突变为组氨酸形成的，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

2.权利要求1所述催化维生素D₃合成25-羟基维生素D₃的P450酶突变体的制备方法，步骤是：

(1)以核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的P450 BM3 F87A基因为模板，以L75A-F/L75A-R或L75G-F/L75G-R或L75T-F/L75T-R或L75H-F/L75H-R为引物分别进行PCR扩增，依次得到命名为P450 BM3 F87A/L75A或P450 BM3 F87A/L75G或P450 BM3 F87A/L75T或P450 BM3F87A/L75H的PCR产物；然后以大肠杆菌表达载体pET30a为载体，分别构建携带所述PCR产物基因P450 BM3 F87A/L75A或P450 BM3 F87A/L75G或P450 BM3 F87A/L75T或P450 BM3F87A/L75H的表达载体；将构建的表达载体pET30a-P450 BM3 F87A/L75A或pET30a-P450BM3 F87A/L75G或pET30a-P450 BM3 F87A/L75T或pET30a-P450 BM3 F87A/L75H分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态中，相应获得的转化子分别命名为BL21(DE3)-pET30a-P450BM3 F87A/L75A或BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3 F87A/L75G或BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3F87A/L75T或BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3 F87A/L75H；

其中，上述引物核苷酸序列分别是：

L75A-F：CAAGCGGCTAAATTTGTACGTGATTTT

L75A-R：AAATTTAGCCGCTTGACTTAAGTTTTT

L75G-F：CAAGCGGGGAAATTTGTACGTGATTTT

L75G-R：AAATTTCCCCGCTTGACTTAAGTTTTT

L75T-F：CAAGCGACGAAATTTGTACGTGATTTT

L75T-R：AAATTTCGTCGCTTGACTTAAGTTTTT

L75H-F：CAAGCGCATAAATTTGTACGTGATTTT

L75H-R：AAATTTATGCGCTTGACTTAAGTTTTT

(2)将获得的四种转化子分别接种到含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，制得四种发酵种子液；将获得的四种发酵种子液分别接种到TB培养基中，在37℃，220rpm的条件下培养至OD₆₀₀＝1.0±0.1后，再分别向发酵培养液中加入0.2mM的IPTG，18℃，180rpm发酵培养24h；将培养后的菌液分别离心弃上清，收集菌体即得到四种产蛋白菌体，分别命名为BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3 F87A/L75A或BL21(DE3)-pET30a-P450BM3 F87A/L75G或BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3 F87A/L75T或BL21(DE3)-pET30a-P450 BM3F87A/L75H，于-80℃冻存；

(3)分别将四种产蛋白菌体超声破碎后进行镍柱亲和层析纯化，即得到P450酶突变体纯化蛋白，获得的纯化蛋白分别命名为P450 BM3 F87A/L75A或P450 BM3 F87A/L75G或P450BM3 F87A/L75T或P450 BM3 F87A/L75H，液氮冷冻，-80℃保存。