[发明专利]一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β‑酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用基于蛋白结构模拟、蛋白连接肽链Linker文库构建和蛋白重组表达分析，构建Tsp3044和β‑Cas的最优重组融合蛋白表达序列；从蛋白异源表达技术上优化表达系统、调控元件、发酵技术和提纯工艺，实现重组Tsp3044/β‑Cas融合蛋白的高效制备平台；验证了重组Tsp3044/β‑Cas融合蛋白的结构自组装与对抗蛋白酶消化的能力。本发明构建了具有显著抵抗蛋白酶消化与肠胃高效递送功能的高分子重组蛋白纳米递送系统，为酪蛋白靶向输送药物分子奠定了技术基础，具有较大的应用潜能。

技术领域

本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂修饰的β-酪蛋白纳米载体的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来，纳米技术的快速发展已在医药、食品、化工和环境等领域发挥了巨大的作用，而高效的递送体系和对生物活性成份的有效保护是纳米技术在医药和食品科学等领域最重要的应用。因此，人们对纳米技术的研究重点大都聚焦在先进纳米材料的开发及应用上，并已取得了显著的成效。例如，根据分子特性和用途特点用于递送系统的各种纳米载体，包括脂质体，醇质体，水凝胶和乳剂等等。酪蛋白是哺乳动物包括牛，羊和人奶中的主要蛋白质，而牛奶中的蛋白质80％以酪蛋白(Casein)为主。牛奶酪蛋白由于其优良稳定的乳化特性，价格低廉、来源广泛、具有良好的生物相容性和生物可降解性等，被作为水包油型乳剂广泛应用于疏水性药物分子和活性化合物的乳化、递送使用。

β-酪蛋白(β-Cas)作为酪蛋白最主要的组成成分，其理化特性与酪蛋白基本相似，具有两亲性和自组装性。当前，其蛋白结构信息和核酸编码序列已被报道，β-酪蛋白有一条单链209个氨基酸残基多肽构成。特别是近年来蛋白分离纯化技术和重组表达技术的发展，β-Cas胶束被广泛应用为口服递送载体，负载塞来昔布、布洛芬、米托蒽醌、柚皮素、紫杉醇以及紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)和喜树碱(伊立替康)等疏水性药物，显著提高了药物的溶解度和稳定性。然而，尽管β-Cas纳米口服递送药物在体外具有优异的成药性，但在临床使用过程发现药物有效成分的吸收主要在小肠部位，而酪蛋白很容易被胃肠道蛋白酶液消化降解，从而导致纳米递送系统遭受严重破坏。因此，针对β-酪蛋白口服递送系统易被胃/胰蛋白酶降解这一关键问题，亟需开发一种新的制备简单、生物兼容性好和绿色无污染的制备技术，为β-Cas作为杰出的口服递送系统并规模化应用奠定技术基础。

蛋白酶抑制剂是一类广泛存在于自然界中的非特异性对蛋白酶有抑制活性的物质，包括胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂等，主要参与生物体内蛋白酶活性的调节，能够高效抑制蛋白酶水解活性。当前，已有大量来源于微生物、植物、动物的蛋白酶抑制剂编码基因被报道，例如，荞麦胰蛋白酶抑制剂编码基因被克隆并通过DNA重组实现在原核大肠杆菌表达系统的活性表达。而牛肺来源的胰蛋白酶抑制剂作为商品化蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床并成为重要的生化药物之一。最近Zhang等人(High-level expression and characterization of two serineprotease inhibitors from Trichinella spiralis，公开于2016年)对来源于旋毛虫的三种丝氨酸蛋白酶重组大肠杆菌系统异源表达，通过系统优化实现了三种蛋白酶抑制剂的高效重组表达，特别是蛋白酶抑制剂Tsp03044和TspAd5均对胃蛋白酶和胰蛋白酶表现出了明显的活性抑制。

那么是否能够利用蛋白酶抑制剂的性能提高β-Cas在人消化系统的耐受性、从而使药物能够精准送达到吸收部位，是目前仍待解决的问题。

发明内容

针对目前存在的问题，发明人尝试将蛋白酶抑制剂与β-Cas进行融合，但是，荞麦胰蛋白酶抑制剂、牛胰蛋白酶抑制剂等仅对胰蛋白酶有抑制活性，而对胃蛋白酶活性极低或没有活性，故没有取得预期的效果，因此，发明人发掘了来源于旋毛虫的对胃蛋白酶和胰蛋白酶均有较好抑制活性的Tsp3044蛋白酶抑制剂，以期能够提升β-Cas在消化系统中的耐受性、从而达到吸收部位。