[发明专利]一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用

说明书

本发明属于细胞工程技术领域，具体公开了一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用。本发明通过SSR#41永生化工具质粒和逆转录病毒系统构建了可逆性永生化肺泡细胞株imPACs，并进一步分选出了可逆性永生化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，为了解Ⅱ型肺泡细胞的功能和作用机制，以及肺相关疾病诊断及治疗的研究提供了更好的细胞模型。进一步地，本发明通过体内外腺病毒Ad‑TGF‑β1干预imPAC2细胞株，以及构建稳定低表达β‑Catenin的imPAC2细胞系(imPAC2‑Si‑β‑Catenin)，还构建了pSEBI‑Kras和pSEBI‑p53R273H稳定过表达Kras及R273H位点突变p53的imPAC2细胞系(imPAC2‑KrasmP53)，为肺纤维化、肿瘤等相关研究提供了良好的细胞工具。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用。

背景技术

肺泡为肺气体交换功能的关键部位，主要由Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞构成，其中祖细胞主要来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞其功能异常与呼吸窘迫综合征，特发性肺纤维化等密切相关。在肺炎症反应或损伤时，除免疫细胞如T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等发挥抗炎症的作用外，肺泡上皮细胞也被认为是能够分泌各种细胞因子而直接作用于炎症或受损部位，从而发挥着巨大的体内自身保护机制。随着再生医学的研究进展，人们发现，在不同的肺损伤区域，存在一些干细胞祖细胞，可通过增殖或诱导定向分化，修复受损器官。因此寻找及鉴定肺的干细胞祖细胞对于研究肺损伤相关疾病治疗和预防等方面显示了极大的研究价值。

认知肺泡内干细胞的基本生物学功能对于了解许多肺部疾病及肺损伤等非常重要。研究发现，Ⅱ型肺泡上皮细胞能增殖分化，在肺损伤和修复中扮演肺泡干细胞的作用，能诱导产生Ⅱ型肺泡上皮细胞和Ⅰ型肺泡上皮细胞。近十几年的研究证实，在小鼠肺损伤和功能重建中，Ⅱ型肺泡上皮细胞可以增殖或分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞。研究证实，不同部位的Ⅱ型肺泡细胞增殖和再生能力有显著差异，但对其进一步的研究却非常少，究竟是何种亚群，以及有些什么特征性标志物或功能也尚不清楚。同时Ⅱ型肺泡细胞如何联系间质细胞，内皮细胞以及一些免疫细胞发挥其自我更新、分化和修复功能也尚不清楚。因此，本研究拟从新生小鼠入手，分离纯化Ⅱ型肺泡上皮细胞，拟寻找鉴定出肺泡干细胞的标志物及诱导其分化的相关信号通路，其研究结果不仅能运用于研究肺发育中重要的生理机制，同时也能用于肺再生医学相关应用研究，具有重要的基础研究与临床应用价值。

原代肺泡细胞体外增殖慢，细胞量获取有限。同时体外长期培养细胞易发生自行分化，反复冻存复苏后也会影响其增殖活性。细胞永生化技术目前已经十分成熟，应用于各个细胞，为成功构建细胞系的有效方法。永生化后细胞增殖活性大大提高，使扩增变得相对较容易，而且永生化后的细胞具有相对稳定的生物学特性，对于该细胞后续研究提供高效而稳定的重要手段。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种可逆性永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用，为研究肺发育中重要的生理机制，以及肺再生医学相关应用研究提供新的细胞模型及技术手段。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种可逆性永生化肺泡细胞系imPACs的构建方法，包括如下步骤：提取小鼠原代肺泡细胞mPACs，采用携带潮霉素B抗性基因和SV40T基因的SSR#41永生化工具质粒，结合FLP/FRT系统制备表达SV40T基因的逆转录病毒，然后运用所述逆转录病毒感染原代肺泡细胞mPACs，使细胞增值，经潮霉素B进行阳性克隆筛选，获得可逆性永生化肺泡细胞系imPACs。

进一步，所述逆转录病毒通过293PA细胞、pCL-Ampho质粒和SSR41质粒包装而得。

进一步，所述pCL-Ampho质粒和SSR41质粒来源于芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室。

进一步，在抗性筛选过程中，潮霉素B的用量为≥0.5mg/ml，优选为0.5mg/ml。