[发明专利]用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的这种试纸条以及试剂盒，利用对肺炎克雷伯菌phoE基因有特异性的PCR引物，能够对肺炎克雷伯菌核酸进行快速、简便、准确、高灵敏度(最低检测限为2×10²copies/mL)的检测，用于快速判断是否感染肺炎克雷伯菌，无需微生物培养过程，不需昂贵仪器，可作为肺炎克雷伯菌感染的临床快速辅助诊断。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)，是一种革兰氏阴性菌，不运动的、包囊的杆状芽孢杆菌，存在于人类和非人类灵长类动物的鼻咽和胃肠道中，属于克雷伯氏菌属和肠杆菌科，兼性厌氧，是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。当机体免疫力降低时，可经呼吸道进入肺内引发典型的原发性肺炎。肺炎克雷伯菌是引起医院获得性肺炎的重要病原体，尤其在革兰氏阴性杆菌肺部感染中，仅次于流感嗜血杆菌，排在第2位，同时也是社区获得性感染如社区获得性肺炎的潜在病原体。肺部病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。克雷伯氏菌对外界抵抗力强，对多数抗生素易产生耐药性。除引起重症肺炎外，还可引起泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。

医院肺炎克雷伯菌标本主要来源为痰液、尿液、分泌物、血液。目前检测肺炎克雷伯菌感染的方法主要包括细菌培养法、血清学检测和实时荧光定量PCR等分子诊断方法。微生物培养法耗时3d左右，且培养条件复杂，不利于早期诊断和治疗。荧光定量PCR技术虽然在临床应用中具有灵敏度高、特异性强等特点，但对实验人员技术要求高，需要具备专业的实验技能和知识背景，并且需要昂贵的qPCR仪器，使得很多核酸检测试剂盒无法普及到基层医院，限制了其推广和应用。常规PCR技术虽然无需昂贵仪器，但获得核酸扩增产物后，需要通过琼脂糖凝胶电泳判断阴阳性，操作费时、繁琐。因此，临床上需要一种操作简便、快速以及准确的鉴定方法。

市面上应用胶体金免疫层析技术开发出的检测试剂盒的检测靶标大部分都为抗体或抗原，这些以检测蛋白为目的的检测试剂盒需要大量单克隆抗体制备，成本昂贵且制备周期长，检测特异性易受到样本基质的影响，在疾病窗口期的病原体检出率方面不具备优势。

发明内容

本发明针对目前肺炎克雷伯菌检测方法的上述弊端，提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、试剂盒及检测方法。本发明提供的这种试剂盒，利用针对肺炎克雷伯菌phoE基因特异性的PCR引物，能够对肺炎克雷伯菌核酸进行快速、简便、准确、高灵敏度的检测。用于快速判断是否感染肺炎克雷伯菌，无需微生物培养过程，不需昂贵仪器，可作为肺炎克雷伯菌感染的临床快速辅助诊断。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物，PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

引物序列为：

正向引物：5’-CATCGTTGATGCCGAGTTTG-3’(SEQ ID NO.1)。

反向引物：5’-GCTATGTGCTGTCGAAAGGGA-3’(SEQ ID NO.2)。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述正向引物的5’端标记有生物素，反向引物的5’端标记有荧光素。

引物序列为：

正向引物：5’-bio-CATCGTTGATGCCGAGTTTG-3’(SEQ ID No.1)，