[发明专利]一种Rheb蛋白激活剂及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种Rheb蛋白激活剂及其应用。本发明利用新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂‑ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb，使得Rheb‑GDP转变为GTP形式，进而发挥疗效，筛选出的ATP6AP1蛋白具有较大的药用价值，尤其在治疗糖尿病领域具有更佳的药用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种Rheb蛋白激活剂及其应用。

背景技术

Rheb是Ras超家族的小GTP酶，有Rheb-GDP和Rheb-GTP两种形式，是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)信号通路的上游正调控因子，与mTORC1信号通路共同调控着细胞生长、增殖和分化等过程。

GDP-GTP交换需要特定因子的参与，即：在GAP催化下Rheb-GTP水解为GDP形式，Rheb-GDP可以被GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)重新激活，转变为GTP形式。目前已知TSC2作为Rheb的GAP(G蛋白调控因子)发挥功能，但目前并未发现已知Rheb的GEF。同时，目前也并未发现体内外可以直接靶向激活Rheb的小分子药物或短肽药物。

Rheb的GEF是哪一类蛋白、其激活过程受什么调控，目前仍是有待解决的科学问题。由于Rheb蛋白本身存在较弱的GTPase活性，因此在细胞中多数情况以GTP结合形式存在，这可能是Rheb的GEF不容易被发现的原因。同时，由于Rheb与其GEF的结合较为瞬时，因此，传统的检测蛋白互作的手段难以发现。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种Rheb蛋白激活剂及其应用。本发明利用新型邻近标记技术筛选方法找到了ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，可以使得Rheb-GDP重新被激活，转变为GTP形式，进而发挥疗效。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种Rheb蛋白激活剂，所述Rheb蛋白激活剂为ATP6AP1蛋白。

第二目的，本发明提供了ATP6AP1蛋白作为靶向Rheb蛋白激活剂的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，采用ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸激活Rheb蛋白，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明人经过大量的实验，筛选得到ATP6AP1蛋白可以作为Rheb的潜在GEF，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸(TYGLHMILSLKTMDRFDDHKGPTISLTQIV)可以直接在体内外激活Rheb，作为直接靶向激活Rheb的激活剂使用。

第三目的，本发明提供了一种筛选Rheb蛋白激活剂的方法，包括以下步骤：

1)构建生物素连接酶与Rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达Rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；

2)向稳定表达Rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；

3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达Rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除(扣除表示为将两组数据中重叠的蛋白去掉，以达到去除对照组干扰的目的)对照细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的Rheb邻近蛋白，分析Rheb邻近蛋白，经鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件，得ATP6AP1蛋白。

更优选地，鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件包括以下条件：

(1)GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与Rheb存在体内外相互作用；