[发明专利]一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法

权利要求书

1.一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤S1：筛选差异性ctDNA甲基化位点；

步骤S2：ctDNA甲基化探针的筛选；

步骤S3：NKTCL的ctDNA甲基化诊断模型的构建与验证；

步骤S4：NKTCL的ctDNA甲基化预后模型的构建与验证。

2.根据权利要求1所述的一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述筛选差异性ctDNA甲基化位点的步骤包括：

S11：收集250-350例NKTCL患者和250-350例正常人的血浆标本；

S12：使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctDNA甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；

S13：通过甲基化水平差异分析，筛选得到p0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；

S14：根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过PCR验证筛选可产生阳性且特异性的PCR扩增信号的甲基化位点。

3.根据权利要求2所述的一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其特征在于，在步骤S12中，所述使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA的步骤包括：

S121：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液GS，震荡至彻底混匀；

S122：加入200μl缓冲液GB和20μl Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，至溶液变清亮；

S123：室温放置2-5min后加入350μl缓冲液BD，充分颠倒混匀。

4.根据权利要求3所述的一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其特征在于，所述步骤S12还包括：

S124：将步骤S123所得溶液加入一个吸附柱CG2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

S125：向吸附柱CG2中加入600μl缓冲液GDB，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

S126：向吸附柱CG2中加入500μl漂洗液PWB，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2室温放置2min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

S127：将吸附柱CG2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种NK/T细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述ctDNA甲基化探针的筛选的步骤为：

S21：收集100例治疗前NKTCL肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织DNA和血浆ctDNA试剂盒提取肿瘤组织DNA和血浆ctDNA，提取步骤同S12；

S22：以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织DNA与相应匹配的血浆ctDNA的候选甲基化位点的甲基化水平；

S23：比对组织标本DNA与血浆ctDNA甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。