[发明专利]一种基于聚集诱导发光比率荧光探针的ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于聚集诱导发光比率荧光探针的ELISA检测方法，比率荧光探针包括红色和绿色的AIE荧光微球。将红色AIE微球偶联抗原，绿色荧光微球偶联生物素或地高辛抗体，ELISA包被抗体和链霉亲和素或地高辛全抗原。在ELISA反应体系中，红色AIE荧光微球偶联的抗原与ELISA上的抗体结合，在610nm处发出红色荧光，读值记为R；绿色AIE荧光微球偶联的生物素与ELISA板上的链霉亲和素结合或地高辛抗体与地高辛全抗原结合，在501nm处发出绿色荧光，读值记为G。通过计算R/G的值可以定量检测目标物浓度。本发明通过自校准将外部干扰降至最低，同时省去使用酶标二抗催化显色不稳定以及ELISA自身繁琐的步骤，为解决传统ELISA方法操作繁琐且易出现背景干扰等问题提供新技术和新思路。

技术领域

本发明涉及酶联免疫吸附技术领域，具体涉及一种基于聚集诱导发光比率荧光探针的ELISA检测方法，其技术原理为直接竞争法或双抗夹心法。

背景技术

ELISA灵敏度高、特异性强、成本低、设备简单，不需要专业的人员操作，可以用于实验室、企业、其他部门等的现场快速检测。尽管到目前为止已经开发了许多ELISA方法并商业化，但ELISA在实际应用过程中仍然存在一些挑战。首先，ELISA的肉眼视觉检查是基于显色强度或亮度的变化，因此在检测过程中显色较弱时难以进行定性或半定量，特别是对于未经培训的检查员或患者。第二，大多数ELISA都是依靠HRP酶催化RAIE显色的单信号响应，定量结果的准确性和灵敏度都受到许多与分析物无关的参数的影响，如酶的稳定性、光漂白和光散射等。因此，解决这些技术问题以促进ELISA的广泛应用，已经成为近年来研究的热门领域。

比率荧光技术是依赖于两个或多个发射波段的强度比来实现目标物的定量检测，现已广泛应用于荧光传感器的设计中。与单一荧光信号不同，比率荧光系统可以通过自校准将外部干扰降至最低，以提高检测灵敏度。此外，比率荧光系统还可以输出具有典型色调的不同颜色，以增强视觉识别。与单纯的颜色强度相比，色调的变化能更好的肉眼读出结果。此外，随着三基色(红-绿-蓝，RGB)的强度变化，色调也会发生变化，因此，可以利用不同颜色的信号强度比(如R/G)来量化目标物浓度。

发明内容

本发明旨在针对现有ELISA在实际操作过程中，酶的稳定性差，易出现背景信号干扰从而导致检测灵敏度偏低的现状缺陷，使用红色和绿色AIE荧光微球比率荧光技术通过自校准将外部干扰降至最低，同时可以省去使用传统酶标二抗以及催化显色不稳定以及繁琐的步骤，为解决传统ELISA方法操作繁琐且易出现背景干扰提供新技术和新思路。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于聚集诱导发光比率荧光探针的ELISA检测方法，所述比率荧光探针包括两种颜色AIE荧光微球，所述AIE荧光微球包括红色AIE荧光微球RAIENPs和绿色AIE荧光微球GAIENPs，所述RAIENPs和GAIENPs为同一激发波长360nm，发射波长分别为501nm和610nm，发射峰无交叠。所述两种颜色荧光微球粒径在150nm±5％和350nm±5％。所述RAIENPs偶联抗原RAIENPs@Antigen，GAIENPs偶联生物素或地高辛抗体(GAIENPs@Bio或GAIENPs@DigmAbs)。所述ELISA包被抗体和链霉亲和素(SA)或地高辛全抗原(Dig-BSA)。所述RAIENPs@Antigen与ELISA上的抗体结合，在610nm处发出红色的荧光，读值记为R；所述GAIENPs@Bio与ELISA板上的SA结合或GAIENPs@DigmAbs与Dig-BSA结合，在501nm处发出绿色荧光，读值记为G。通过计算R/G的值可以定量检测目标物浓度。

其中，两种AIE荧光微球的合成步骤如下：